Xxiv международная медико-биологическая конференция молодых исследователей Фундаментальная наука и клиническая

ПОВЫШЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ 
ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ 
ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НАНОВЕЗИКУЛ В ПЛАЗМЕ 
МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
Никифорова Н.С., н.с., Назарова И.В., н.с., 
Забегина Л.М., м.н.с., Сидина Е.И., н.с.
Национальный медицинский исследовательский центр 
онкологии имени Н.Н. Петрова,
Санкт-Петербург, Россия
Научные руководители: Малек А.В. д.м.н., Шаройко В.В., д.б.н., в.н.с. 
Жидкая биопсия — не новая, но все же привлекательная стра-
тегия диагностики рака. Недавние исследования циркулирующих 
наноразмерных компонентов крови открыли новый класс маркеров 
рака. Например, внеклеточные нановезикулы (ВНВ) секретируются 
всеми типами клеток во внеклеточное пространство и циркулиру-
ют в плазме. ВНВ сохраняют тканеспецифический паттерн транс-
мембранных белков, а также внутреннее содержимое (нуклеиновые 
кислоты и другие компоненты). Считается, что ВНВ, секретируемые 
злокачественными клетками, отражают специфические характери-
стики рака, и их обнаружение представляет собой многообещаю-
щий подход к диагностике рака.
Стандартные подходы к анализу образованных из опухоли ВНВ 
(о-ВНВ) в плазме предполагают последовательные этапы выделе-
ния ВНВ с последующими иммунномечениями и количественной 
оценкой. Однако этот метод недостаточно чувствителен для обна-
ружения небольшой доли о-ВНВ в общей популяции плазменных 
везикул, что ставит под угрозу общий подход, основанный на ВНВ, 
для ранней диагностики рака. Для повышения чувствительности 
метода мы исследовали «обратную» технологию количественной 
оценки о-ВНВ. Сначала мы окрашивали все мембранные компонен-
ты плазмы липофильным красителем CM-Dil. Далее выделяли попу-
ляцию ВНВ, образованную эндосомным путем (экзосомы), методом 
эксклюзионной хроматографии. Затем количественно оценили опу-
холеспецифическую фракцию этих везикул с помощью проточной 

---

416
ОНКОЛОГИЯ, ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ И ИХ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ОСНОВЫ
цитометрии на частицах, связанных с антителами. Такой подход по-
зволил нам значительно повысить чувствительность обнаружения 
о-ВНВ в плазме.
Чтобы подтвердить это утверждение, смешали плазму с раз-
личным количеством о-ВНВ, полученных из клеток рака толстой 
кишки (Colo320). о-ВНВ выделяли последовательным ультрацен-
трифугированием, концентрацию оценивали методом анализа тра-
ектории наночастиц (NanoSight NS300), и добавляли в плазму. Пред-
лагаемым методом были обработаны три образца донорской плазмы
(2 мл), содержащие 20*10
10
, 10*10
10
и 1*10
10
о-ВНВ. Методом проточ-
ной цитометрии (CytoFLEX) на иммунно-частицах оценили коли-
чество ВНВ, положительных по специфичным маркерам эпителия 
толстой кишки GPA33 и REG4. Получен градиент сигнала: 272, 177, 
119 (CV,%) и 346, 179, 83 (CV,%) соответственно. Поскольку долю ис-
кусственно смешанных о-ВНВ можно оценить в диапазоне 0,1-1% от 
общего количества ВНВ в плазме, предложенный метод обеспечи-
вает исключительную чувствительность для обнаружения о-ВНВ и 
может быть применен для скрининга рака. 

---

ОНКОЛОГИЯ, ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ И ИХ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ОСНОВЫ
417