Xom sutdagi ksantinoksidaza fermenti faolligini aniklash

Xom sutdagi ksantinoksidaza fermenti faolligini aniklash

Muayyan sharoitlarda ksantin oksidaza elektron va protonlarni nafaqat atmosfera kislorodiga, balki sitoxrom tizimiga ham o'tkazishi mumkin. Eksperimental sharoitda ksantin oksidaza metilen ko'k va boshqa bo'yoqlarni, masalan, indigo, indofenol va boshqalarni kamaytirish orqali substratni oksidlashga qodir.

Ksantin oksidazaning optimal ta'siri pH 5,5 dan 8,5 gacha bo'lgan diapazonda yotadi. Ksantin oksidaza - bu metall molibden (M0) ni o'z ichiga olgan flavoprotein. Flavoproidlar protez guruhi sifatida sariq rangli moddalarga ega va flavin mononukleotid (FMN) yoki flavin adenin dinukleotid (FAD) turiga qarab tuzilgan.

Qaytarilgandan so'ng FMN va FAD dihidro shaklga aylanadi. Suv molekulasini hosil qilish uchun substratning molekulyar kislorod bilan oksidlanishini katalizlaydigan gemik oksidazlardan (sitoxrom oksidazalar) farqli o'laroq, flavin oksidazalarning substratga ta'siri natijasida vodorod peroksid hosil bo'ladi.

Vodorod periksni yo'q qilish hemik fermentlar katalaza va peroksidaza ishtirokida amalga oshiriladi. Agar vodorod peroksid reaksiya sferasidan chiqarilmasa, flavin oksidazalarning ta'siri to'xtaydi.

Usulning ishlash printsipi.Ksantin oksidaza fermenti bo'lgan yangi sutga formaldegid va metilen ko'k qo'shilsa va aralashma kisloroddan ajratilsa, biroz vaqt o'tgach ko'k rang yo'qoladi.

Reaksiya formaldegidning chumoli kislotaga oksidlanishi hisobiga metilen ko‘kining leykoformaga tushishi bilan bog‘liq va ksantin oksidaza fermentining katalitik ta’siri tufayli davom etadi.

Materiallar va reaktivlar: yangi sut; 0,4% formaldegid eritmasi; 0,02 n. metilen ko'k eritmasi; Vazelin moyi.

+Uskunalar: suv hammomi; termostat; kimyoviy sinov naychalari.

Ishning borishi.Uchta probirkaga 5 ml yangi sigir sutidan quying. Bitta namuna 2-3 daqiqa qaynatiladi va sovutiladi. Qaynatilgan probirkaga va qaynatilmagan namunalardan biriga 1 ml 0,4% li formaldegid eritmasidan, ikkinchisiga esa 1 ml suv soling. So`ngra uchta probirkaga 1 ml dan metilen ko`kning 0,1% li eritmasidan quyiladi. Probirkalarning tarkibi yaxshilab aralashtiriladi va suyuqlikni atmosfera kislorodi bilan aloqa qilishdan himoya qilish uchun 3-4 tomchi vazelin moyi bilan quyiladi. Barcha namunalar 400C gacha qizdirilgan suv hammomiga joylashtiriladi. Bir muncha vaqt o'tgach, substratni o'z ichiga olgan qaynatilmagan namunadagi suyuqlik metilen ko'kning qaytarilgan shaklini hosil bo'lishi sababli rangsiz bo'ladi.

Metilen ko‘kning rangsiz eritmasi chayqatilsa, eritma yana ko‘k rangga aylanadi.

Birinchi qaynatilgan namunada faol ferment va qaynatilmagan namunalarning birida substrat yo'qligi sababli ularda metilen ko'k rangi o'zgarishi sodir bo'lmaydi.