O’zbekiston respublikasi oliy va o’rta maxsus ta’lim vazirligi qarshi Davlat universiteti Kimyo biologiya fakulteti biologiya yo’nalishi 018-60 gurux talabasi Abduraxmonova Dilbarning Bioinformatika fanidan tayyorlagan kursi sh I reja

Real vaqtdagi (Real-time PCR) PZR-amplifikatsiyasini o’tkazish

TBGP bilan assotsiatsiyalangan CYP21 genida tez-tez uchrovchi mutatsiyalarni aniqlash uchun yangi DNK-diagnostika sistemasi ishlab chiqarilgan bo’lib, uning asosida Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya (Real-time Polymerase Chain Reaction) yotadi, tez-tez uchrovchi 8 ta mutatsiyalar uchun yangi allel-spetsifik praymer (qisqa oligonukleotid fragmentlari) va TaqMan zondi ishlatiladi. Avvaliga metod sun’iy matritsada test qilib ko’rilgan, bunda yo’nalishli mutagenez yordamida analiz qilinuvchi mutatsiyaga kiritiladi va keyin giperandrogeniyaning klinik va bioximik belgilari namoyon bo’lgan bemorlarning klinik materiali bo’lgan DNK da tekshirilgan va ulardan bittasida mutatsiya topilgan: u nonsens (nukleotidlar ketma-ketligi almashishi natijasida aminokislotalar o’zgarishidan yoki stop kodon paydo bo’lishi natijasida yuzaga keladigan mutatsiya ) – mutatsiya Q318X bo’lib, aminokislotalarning o’rin almashishidan kelib chiqadigan mutatsiya hisoblanadi. Shunday qilib, CYP21 genining PZR mahsulotlari real vaqtdagi PZR-amplifikatsiyada o’tkazilib, natijada aniq natijalar olinadi.

Bu metod 5'-ekzonukleaza polimeraza faolligiga asoslangan. Reaktsion aralashmada muhim komponent hisoblangan DNK zondlar o’zida 5' holatdagi fluorestsent bo’yoq va 3' holatdagi fluorestsentsiyani o’chiruvchi (masalan, FAM _TGATCGGGTGGAGTCCTGCC_BH1 zondini oladigan bo’lsak, bu yerda FAM - fluorestsent bo’yoq bo’lsa, BH1 esa fluorestsentsiyani o’chiruvchidir, ular orasida ma’lum bir nukleotidlar ketma-ketligi joylashgan ) kabi qismlardan iborat hamda fosfat guruh 3' holatda joylashgan bo’ladi. Bu zondlar amplifikatsiyalanayotgan sohada komplimentarlik asosida joylashadi. Fluorestsent o’chiruvchi fluorestsent bo’yoq tomonidan ajralayotgan yorug’likni yutadi, fosfat guruhi esa 3' holatdagi polimerazani bloklaydi. Agar WT aralashmasi bo’lgan namunada FAM flyuorestsent bo’yog’ini oshishi kuzatilsa C1994T (CYP21 genining 8-ekzonida yuzaga keladigan mutatsiya) mutatsiyasi namoyon bo’lmaydi. Geterozigota mutatsiyani mavjudligida esa bir vaqtning o’zida Wild Type va Mutant aralashmalaridagi namunalarda flouressentsiya bo’yoq – FAMni ko’payishi kuzatiladi. Faqat Mutant aralashmasidagi namunalarda flyurestsentsiya belgi – FAMni ko’payishi esa gomozigota mutatsiyadan darak beradi.
3- jadval. 21-gidroksilaza genidagi C1994T mutatsiyasini aniqlashda ishlatiladigan allel-spetsifik praymer va zondlar