Введение. Цель, задачи предмета

Рис. 11. Строение одной цепочки ДНК Вся «лестница» ДНК закручена в спираль (рис. 12). Между двумя цепочками азотистые основания располагаются закономерно: аденин








3


5




Рис. 12. Модель двухцепочечной структуры ДНК по Уотсону и Крику
всегда против тимина, гуанин - против цитозина. Иными словами, аденин комплементарен тимину, гуанин - цитозину.
Молекулы ДНК обладают способностью к удвоению (репликации). В основе процесса удвоения лежит принцип комплементарности.
Количественное соотношение нуклеотидов в молекуле ДНК известны в виде правил Чаргаффа:

1. 
   ГА = ГГ или ГА / ГГ = 1
   
2. 
   ГГ = ГЦ или ГГ / ГЦ = 1
   
3. 
   Г(А + г) = Г(Т + Ц) или Г(А + Г) / Г(Т + Ц) = 1
   
4. 
   Количество комплементарных оснований А + Т и Г + Ц у разных видов живых организмов различно. Отношение Г(Г + Ц) / Г(А + Т) является важнейшей характеристикой ДНК, как показатель специфичности её нуклеотидного состава.
   

Коэффициент специфичности у ДНК варьирует от 0,45 до 2,57 у микроорганизмов, от 0,58 до 0,94 у высших растений и от 0,54 до 0,81 у животных.

2. 
   Реализация генетической информации.
   

Информация о расположении аминокислот в молекуле белка записана и хранится в ДНК в виде определённой последовательности нуклеотидов. Считывание информации с ДНК осуществляется с помощью рибонуклеиновых кислот (РНК). Процесс расшифровки начинается с синтеза информационной РНК (и-РНК). Информационная РНК - полимер, состоящий из одной цепочки нуклеотидов. В состав нуклеотидов также входят азотистые основания, моносахарид рибоза и остаток фосфорной кислоты. Азотистых оснований в РНК также четыре: аденин, урацил (У), гуанин, цитозин.
Информационная РНК по принципу комплементарности снимает информацию с ДНК. Этот процесс называется транскрипцией. Важно подчеркнуть, что и-РНК транскрибируется всегда только с одной цепочки ДНК в направлении от 3’ к 5’ концу (рис 13.).
ДНК 5’- Т - Г - Г - Т - А - Т -3’
3’- А - Ц - Ц - А- Т - А -5’
и-РНК 5’- У - Г - Г - У -А - У -3’ ►
направление
Рис. 13. Схема строения ДНК и транскрипции и-РНК.
Следующий этап расшифровки генетической информации происходит на рибосомах (полисомах), где осуществляется синтез полипептидной цепи белков по матрице и-РНК. Этот процесс называется трансляцией. В нем кроме и-РНК также участвуют транспортные РНК (т-РНК), функция которых состоит в том, чтобы доставить аминокислоты к рибосомам и найти им своё место в полипептидной цепи, предусмотренное кодом.
Следует отметить, что в ходе трансляции считывание генетической информации осуществляется с молекулы и-РНК в направлении от 5’ к 3’ концу цепочки.
Генетический код в настоящее время расшифрован для всех 20 аминокислот и составлен по и-РНК в виде таблицы (табл. 2).
В таблице 2 сокращенные названия аминокислот даны по международной терминологии.

Таблица 2. Соответствие кодонов и-РНК аминокислотам

Основания кодонов
первое	второе	третье
		У	Ц	А	Г
	У	Фен	Фен	Лей	Лей
У	Ц	Сер	Сер	Сер	Сер
	А	Тир	Тир	-	—
	Г	Цис	Цис	—	Три
	У	Лей	Лей	Лей	Лей
Ц	Ц	Про	Про	Про	Про
^Ц	А	Гис	Гис	Глн	Глн
	Г	Арг	Арг	Арг	Арг
	У	Иле	Иле	Иле	Мет
А	Ц	Тре	Тре	Тре	Тре
	А	Асн	Асн	Лиз	Лиз
	Г	Сер	Сер	Арг	Арг
	У	Вал	Вал	Вал	Вал
	Ц	Ала	Ала	Ала	Ала
1	А	Асп	Асп	Глу	Глу
	Г	Гли	Гли	Гли	Гли

Примечание. Обозначения аминокислот: Ала - аланин, Арг - аргинин, Асп - аспарагиновая кислота, Асн - аспарагин, Вал - валин, Гис - гистидин, Гли - глицин, Глн - глутамин, Глу - глутаминовая кислота, Иле - изолейцин, Лей - лейцин, Лиз - лизин, Мет - метионин, Про - пролин, Сер - серин, Тир - тирозин. Тре - треонин, Три - триптофан, Фен - фенилаланин, Цис -цистеин.

3. 
   Свойства генетического кода.
   

Генетический код триплетен, т.е. каждую аминокислоту кодируют три рядом стоящие нуклеотида (кодон). Триплеты УАА, УАГ и УГА являются стоп-кодонами.
Генетический код вырожден, т.е. 18 из 20 аминокислот кодируются более чем одним кодоном. Например, каждая из 5 аминокислот - пролин, треонин, валин, аланин и глицин, кодируются четырьмя различными кодонами, а лейцин, аргенин и серин - шестью (табл. 2).
Ключевые слова и понятия

молекулярная генетика	информационная РНК (и-РНК)
Ген	транскрипция
дезоксирибонуклеиновая кислота	рибосома
(ДНК)	трансляция
молекула ДНК	транспортная РНК (т-РНК)
Нуклеотид	генетический код
Репликация	триплет
принцип комплементарности	кодон
правила Чаргаффа	стоп-кодон
рибонуклеиновая кислота (РНК)	вырожденность кода

Лекция 9. МАТЕРИАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ
План:
Как мы уже говорили, биотехнология - это целенаправленное получение ценных продуктов за счет использования биохимической деятельности микроорганизмов, изолированных клеток или их компонентов. Преимущества биотехнологических производств: - возможность получения специфичных и уникальных природных веществ, часть из которых (например, белки, ДНК) еще не удается получать другим путем (например, химическим синтезом); - проведение биотехнологических процессов при относительно невысоких температурах и давлениях; - высокие скорости роста и накопления биомассы; - использование в качестве сырья дешевых отходов сельского хозяйства и промышленности; - биотехнологические процессы обычно экологичны, дают меньше вредных отходов и близки к протекающим в природе естественным процессам; - технология и аппаратура биотехнологических производств просты, а также недороги. Продукты биотехнологии получают по индивидуальным технологиям, используя для этого определенные биологические агенты, сырье, число стадий производства и их технологические режимы, которые могут сильно варьировать. И то же время для всех биотехнологических производств существует типовая схема. 5 К определяющим факторам биотехнологического процесса относят: - вид используемого биотехнологического процесса; - субстрат с его биохимическими и биофизическими характеристиками; - аппаратуру, включая систему контроля управления; технологический режим и соответствие требованиям ГОСТа. Промышленный биотехнологический процесс, в котором производства коммерческих продуктов используют клеточные системы или микроорганизмы, обычно включает три ключевые стадии: - подготовительную (обработка сырья, используемого в качестве источника питательных веществ, и приготовление,если это необходимо, питательных сред); - биотехнологическую (рост микроорганизмов-мишеней Миом - обычно объемом более 100 л - биореакторе (ферментация) с последующим образованием нужного метаболита, например антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформация)); - получение готовой продукции (очистка целевого продукта от компонентов культуральной среды или от клеточной массы). Подготовительная стадия необходима для приготовления сырья, используемого в биотехнологическом процессе. В зависимости от целевого продукта, при этом предусматриваются: - приготовление среды, включающей необходимые компоненты питания для организмов, и ее стерилизация (для асептических биотехнологических процессов, при которых нежелательно попадание посторонней микрофлоры); - подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха) путем очистки от пыли, влаги и присутствующих в воздухе микроорганизмов, включая споры; - подготовка посевного материала, в том числе культивирование микроорганизмов, изолированных клеток растений или животных; - подготовка биокатализатора - либо фермента н свободном или закрепленном на носителе виде, либо биомассы микроорганизмов, выращенных до состояния, в котором проявляется их ферментативная активность; - предварительная обработка сырья, если оно поступает в непригодном для непосредственного использования биотехнологическом процессе виде. Например, при получена спирта пшеницу сначала дробят, а затем подвергают ферментативному процессу «осахаривания». Другой пример использование древесины для получения дрожжей: ее сначала измельчают, а затем подвергают нагреву до 200 °С в кислой среде. В результате кислотного гидролиза происходит превращение древесины в раствор глюкозы и лигнин. Раствор глюкозы (гидролизат) как раз и используют в биотехнологическом процессе для получения кормовых дрожжей. Биотехнологическая стадия - основная в биотехнологическом производстве. Именно на этой стадии с использованием того или иного биологического агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов или клеточных органелл) происходит преобразование сырья в тот или и целевой продукт. Главной целью является получение определенного органического вещества. Однако биотехнологическая стадия, как правило, включает не только синтез новых органических соединений, но и ряд других биотехнологических процессов, таких, как: - ферментация - процесс, осуществляемый с помощью ферментов культивируемых 6 микроорганизмов; - биотрансформация - процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток или готовых ферментов; - биокатализ - химические превращения вещества, протекающие с использованием биокатализаторов-ферментов; - биоокисление - окисление загрязняющих веществ с помощью микроорганизмов или ассоциации микроорганизмов в аэробных условиях; - метановое брожение - переработка органических отходов с помощью ассоциации метаногенных микроорганизмов в анаэробных условиях; - биокомпостирование - снижение содержания вредных органических веществ в твердых отходах; - биосорбция - сорбция вредных примесей из газов или жидкостей (обычно осуществляется закрепленными на специальных твердых носителях микроорганизмами); - бактериальное выщелачивание - процесс перевода нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов; - биодеградация - разрушение вредных соединений, осуществляемая микроорганизмами-биодеструкторами. Обычно биотехнологическая стадия завершается выходим одного жидкостного и одного газового потоков, иногда - только одного жидкостного или переработанного твердого продукта, например при созревании сыра или биокомпостированиии отходов. Получение готовой продукции - заключительная стадия технологического процесса биотехнологического производства. Чаще всего целевой продукт находится либо в caмой биомассе, либо в жидкости. В зависимости от свойств биомассы и жидкости, для их разделения могут быть использованы различные методы: - отстаивание - разделение под действием гравитационных сил (обычно при очистке сточных вод); - фильтрация - пропускание суспензии через фильтрующий материал, на котором задерживаются частицы твердойl фазы - биомасса. Такой способ применяют в производстве антибиотиков, особенно в тех случаях, когда микроорганизм-продуцент имеет мицелиальный характер; - сепарация, центрифугирование - разделение под действием центробежных сил. Наиболее часто используют для отделения дрожжей или бактерий в производстве кормовой биомассы; - микрофильтрация, ультрафилътрация - пропускание суспензии через мембраны с весьма малым размером пор, обеспечивающее удерживание клеток микроорганизмов на мембране и получение чистого раствора. При ультрафильтрации отделяются не только клетки, но и крупные молекулы растворенных веществ; - коагуляция - добавление в суспензию реагентов, способствующих образованию и осаждению более крупных клеточных частиц и отделению их от жидкости методом от стаивания; - флотация - захват микроорганизмов пузырьками пены и выделение их из пенной фракции. Целевые продукты биосинтеза могут быть внеклеточными и внутриклеточными. Для внутриклеточных продуктов сначала необходимо разрушить оболочку клеток. Это 7 можно осуществить дезинтеграцией клеток, разрушив клеточную оболочку физическими методами (с помощью мелющих тел, путем замораживания и продавливания, воздействием ультразвуком, методом декомпрессии - резкого сброса давления) или химическими и биотехнологическими методами. Используют также гидролиз (разрушение клеточных оболочек под действием химических реагентов и температуры), ферментолиз (разрушение клеточных оболочек под действием ферментов при повышенной температуре) или автолиз (разновидность ферментолиза, когда используют собственные ферменты клетки). После проведения какой-либо из вышеперечисленных операций дальнейшее выделение целевого продукта осуществляют методами, общими для внеклеточных и внутриклеточных продуктов. Основными из них являются: - экстракция - переход целевого продукта из водной фазы в не смешивающуюся с водой органическую жидкость (экстрагент). Наиболее известно выделение жироподобных веществ жидкими углеводородами (типа бензина). Применяют и многие другие виды экстрагентов (хлороформ, эфир, бутилацетат). Иногда экстракцию осуществляют непосредственно из биомассы микроорганизмов; - осаждение - выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящего его в твердую фазу; - адсорбция - перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его сорбции на специальных твердых носителях (сорбентах); - ионный обмен - в твердую фазу переходят ионы (катионы или анионы), а не молекула целевого продукта или примеси; - отгонка, ректификация - выделение растворенных в культуральной жидкости легкокипящих продуктов, например этилового спирта; - улътрафилътрация, нанофильтрация и обратный осмос - выделение высокомолекулярных соединений (белков, полипептидов, полинуклеотидов). Обратный осмос и нано-фнльтрация позволяют отделять даже небольшие по размеру молекулы; - центрифугирование, ультрацентрифугирование - выделение вирусов, клеточных органелл, высокомолекулярных соединений. Очистка необходима для получения биопродуктов высокой степени чистоты. Основной целью является удаление примесей, что достигается с помощью экстракции, адсорби , ионного обмена, ультрафильтрации, обратного осмоса, ректификации и ферментолиза, которые были рассмотрены ранее. Кроме перечисленных, используют и другие процесы, такие, как: - хроматография - процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, часто близкие по структуре (например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков). При адсорбции они десорбируются вместе, а вот при хроматографии они выделяются из сорбента как бы по очереди, что позволяет отдел ить их друг от друга; - диализ - процесс, в котором через полупроницаемую пленку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей; - кристаллизация - процесс, основанный на различной растворимости веществ при разных температурах. Медленное охлаждение позволяет формировать кристаллы из 8 растворов целевых продуктов, причем чистота их обычно очень высока. Таким образом, например, получают кристаллы пенициллина. Можно даже получить еще более чистый продукт, если кристаллы растворить в воде или растворителе, а потом снова кристаллизовать (т. е. провести процесс перекристаллизации). Концентрирование продукта повышает его выход. Известно, что после биотехнологической стадии содержание продукта обычно составляет примерно 0,1-1 %, после стадии отделения биомассы - 0,1-2 %, после стадии выделения - 1-10 %, после стадии очистки - 50-80 % и, наконец, после стадии концентрирования -90-100 %. На стадии концентрирования применяют такие процессы, как выпаривание, сушка, осаждение, кристаллизация, фильтрация, ультрафильтрация, гиперфильтрация или на нофильтрация, обеспечивающие как бы отжим растворите ля из раствора. Получение готовой формы продукта завершает биотехнологическое производство. Продукт приобретает товарную форму за счет проведения процессов гранулирования (формирование гранул из порошка или прямо из раствора), дражирования, таблетирования (формирование драже, таблеток), розлива или фасовки, ампулирования (затаривания в ампулы).