Введение. Цель, задачи предмета

Лекция 11: ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ФЕРМЕНТНОЙ ИНЖЕНЕРИИ

К числу таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, ДНК-метилтрансферазы, эндонуклеазы рестрикции, ферменты репарации, ДНК-лигазы и т.д.

Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидного обмена.
К числу таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, обеспечивающие воспроизведение молекул нуклеиновых кислот в клетке; ДНК-метилтрансферазы, ответственные за присоединение к ДНК метильных групп; эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов в ДНК и разрезать ДНК в определенных местах; ферменты репарации, исправляющие ошибки (мутации) в ДНК, ДНК-лигазы, сшивающие нити ДНК и т.д.
Из большого арсенала методов анализа ДНК полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на циклической репликации матрицы (реакцию проводят, циклически поднимая и понижая температуру, обычно в пределах от 40–55 до 95°C), наиболее широко применяется в генно-инженерной практике и клинической диагностике. В основе современной методологии ПЦР лежит использование термостабильной ДНК-полимеразы из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-ДНК-полимеразы). Температурный оптимум ферментативной активности Taq-ДНК-полимеразы составляет 70–72°С, фермент сохраняет активность и при 95°C. Taq-ДНК-полимераза состоит из двух глобулярных пространственно разделенных доменов: полимеризационного, осуществляющего встраивание нуклеотидов в растущую цепь ДНК, и домена, обладающего 5’–3’-экзонуклеазной активностью. Благодаря 5’–3’-экзонуклеазной активности Taq-ДНК-полимераза расщепляет небольшие фрагменты ДНК, присоединенные к цепи ДНК, которая используется в качестве матрицы при полимеризации. Такое свойство фермента нашло применение в количественных методиках ПЦР для разрушения флуоресцентных зондов.
Однако с точки зрения современных требований, предъявляемых к полимеразам, Taq-ДНК-полимераза обладает рядом недостатков. Фермент допускает ошибки при полимеризации ДНК, не способен к синтезу достаточно протяженных фрагментов НК, не обладает корректирующей (3’–5’-экзонуклеазной) активностью, недостаточно термостабилен, имеет невысокую скорость полимеризации и процессивность. 5’–3’-экзонуклеазная активность Taq-ДНК-полимеразы не удовлетворяет требованиям современных методов анализа ДНК. Нативный фермент не может использовать РНК в качестве матрицы.
Ряд отмеченных проблем можно снять, применяя в ПЦР ДНК-полимеразы из гипертермофильных архейных микроорганизмов, способных существовать при температурах, близких к температуре кипения. Например, фермент из микроорганизма Pyrococcus furiosus обладает более высокой термостабильностью и точностью при синтезе ДНК, способен обеспечивать синтез протяженных фрагментов НК. Такие свойства фермента являются следствием наличия у него 3’–5’-корректирующей нуклеазной активности. Среди недостатков Pfu-ДНК-полимеразы следует отметить относительно низкую эффективность полимеризации, более низкую по сравнению с Taq-ДНК-полимеразой скорость полимеризации, отсутствие способности к синтезу ДНК на матрице РНК.
Таким образом, фермент со свойствами, оптимальными для ПЦР, в природе пока не обнаружен. Создание эффективной ДНК/РНК полимеразы – актуальная задача сегодняшнего дня.
Создание эффективной ДНК/РНК полимеразы
Ученые из лаборатории генетической регуляции биохимических процессов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством кандидата биологических наук Владимира Лунина имеют существенный опыт в области создания продуцентов ферментов для молекулярной биологии и генетической инженерии. Группой исследователей проклонированы гены и созданы эффективные продуценты следующих ферментов нуклеотидного обмена: Thermus aquaticus ДНК полимеразы, Thermus thermophilus ДНК полимеразы/ревертазы, Klenow фрагмента ДНК полимеразы I E. coli, M-MLV ревертазы (Moloney), Thermus thermophilus неорганической пирофосфатазы (PPi), Thermus thermophilus ДНК лигазы, E. coli ДНК-лигазы, T4 ДНК-лигазы, Thermus thermophilus РНКазы H, E. coli РНКазы H, T4-полинуклеотид киназы, урацил-ДНК-гликозилазы E. сoli (UDG), Thermus aquaticus структуроспецифической эндонуклеазы (5’–3’-экзонуклеазы).
С помощью методов генной и белковой инженерии ученые получили модифицированные производные и разработали технологии получения полимераз второго поколения: Thermus aquaticus ДНК-полимеразы без ДНК E. сoli, Thermus aquaticus ДНК-полимеразы без ДНК E. coli и Homo sapiens, химически модифицированной Taq-ДНК-полимеразы (Thermostar ДНК полимеразы) со встроенным «горячим стартом», Taq-ДНК-полимеразы в комплексе с моноклональными антителами, также обеспечивающими «горячий старт», генетически модифицированной Taq -ДНК-полимеразы для секвенирования ДНК.
Препараты ферментов имеют низкую себестоимость и ориентированы на массовое применение. По своим качественным характеристикам они соответствуют мировому уровню и широко используются в генно-инженерной и молекулярно-биологической практике в России.
Из оригинальных ферментов и реагентов для генетической инженерии учеными лаборатории проклонированы гены и созданы следующие препараты: ДНК-полимераза из Archaeoglobus fulgidus – гипертермофильного архейного микроорганизма (данный фермент лишь на 37% гомологичен Pfu-ДНК-полимеразе); АТФ-зависимая ДНК-лигаза из Archaeoglobus fulgidus; активатор Taq-ДНК-полимеразы – неспецифический ДНК-связывающийся белок, повышающий точность и эффективность работы Taq-ДНК-полимеразы; NС-белок вируса лейкемии кошек – неспецифически ДНК/РНК-связывающий белок, повышающий эффективность работы M-MLV ревертазы; фрагмент тяжелой цепи моноклонального антитела к Taq-ДНК-полимеразе; Hot Start Compound (HS) – химически синтезированный олигонуклеотид, образующий комплекс с Taq-ДНК-полимеразой и ингибирующий ее активность при низкой температуре.
Получение ферментов нуклеотидного обмена с улучшенными характеристиками
В настоящее время в лаборатории планируется создать новые ферменты с улучшенными свойствами для целей амплификации и модификации нуклеиновых кислот и провести масштабирование процессов их выделения и очистки.
Стандартным подходом для улучшения свойств полимераз стало получение химерных белков, в которых к полимеразному домену присоединен неспецифический ДНК-связывающийся домен. Химерные полимеразы будут иметь улучшенные характеристики в точности и скорости синтеза, процессивности, продуктивности, способности к синтезу протяженных фрагментов и устойчивости к высоким концентрациям солей. В соответствии с этой идеологией исследователи из лаборатории генетической регуляции биохимических процессов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН работают над созданием химерных полимераз (традиционных из Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus и оригинальных из Thermotoga neapolitana, Archaeoglobus fulgidus) с описанным в литературе ДНК-связывающим доменом Sso7d и проклонированным авторами из Thermus aquaticus термостабильным неспецифическим ДНК-связывающим доменом. Разрабатывается химерная M-MLV ревертаза с неспецифически ДНК/РНК-связывающим NC белком вируса лейкемии кошек; химерные 5’–3’-экзонуклеазы (структуроспецифические эндонуклеазы) (традиционные из Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus и оригинальные из Thermotoga neapolitana и Archaeo-globus fulgidus) с термостабильными неспецифическими доменами, связывающими двухцепочечную ДНК.
Создание улучшенных вариантов ДНК полимераз с «горячим стартом»
Исследователи под руководством Владимира Лунина проклонировали фрагмент моноклонального однодоменного антитела к Taq-ДНК-полимеразе, получили его эффективный бактериальный продуцент и в настоящий момент изучают ингибирующие свойства однодоменного антитела. На основе полученных данных будет создан препарат Taq-ДНК-полимеразы с однодоменным антителом, образующим комплекс с ферментом и, таким образом, обеспечивающим «горячий старт» ПЦР.
Системы, предотвращающие контаминацию, с использованием урацил-ДНК-гликозилаз
Высокая чувствительность метода ПЦР обусловливает и основную проблему применения самого метода – контаминацию (загрязнение лабораторного помещения продуктами ПЦР). В основе ПЦР-контаминации лежит попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты. Одним из основных способов борьбы с контаминацией является использование в реакционной смеси вместо одного из нуклеозидтрифосфатов – дезокситимидинтрифосфата (dTTP), неканонического, характерного для РНК, дезоксиуридинтрифосфата (dUTP). В результате получаемые фрагменты ДНК оказываются «мечеными» дезоксиурацилом. Специальный термолабильный фермент – урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) используется для пред-обработки реакционной смеси перед проведением ПЦР. UDG выщепляет дезоксиурацил из ДНК и делает непригодными для полимеразной реакции случайно попавшие в пробирку контаминирующие фрагменты. В то же время природная матрица не содержит дезоксиурацила и с нее начинает нарабатываться специфический продукт (в свою очередь, меченый дезоксиурацилом). Специфический продукт во время реакции остается интактным и не расщепляется UDG, поскольку присутствующий в пробирке термолабильный фермент инактивируется в первые же минуты при нагревании реакционной смеси до 95°С. Данная технология реализована в нескольких полученных учеными универсальных ПЦР-наборах с урацил-ДНК-гликозилазой, дезоксиурацил-трифосфатом и разными вариантами ДНК-полимераз со встроенным «горячим стартом».
Свойства созданных ферментов и характеристики исследовательских наборов будут испытаны в различных методиках, применяемых в молекулярно-биологической и генно-инженерной практике в институте молекулярной генетики РАН, НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалея РАМН. Разработанные на основе новых ферментов ПЦР-наборы пройдут проверку при тестировании патогенных и генетически модифицированных микроорганизмов в НИИЭМ им Н.Ф. Гамалея РАМН и при выявлении генетически модифицированных растений в Институте питания РАМН.
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы в генной инженерии
Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент ( фрагмент Кленова ), Т4-ДНК-полимераза и термостабильные ДНК-полимеразы, особенно ДНК-полимераза Thermus aquaticus ( Taq-полимераза ). Все эти ферменты в присутствии ионов Mg2+ из четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и TTP) осуществляют синтез ДНК, комплементарной матричной ДНК, и для функционирования требуют наличия затравки на одноцепочечной матричной ДНК, т.е. олиго- или полидезоксирибонуклеотида со свободным 3'-ОН-концом, комплементарного матричной ДНК.
ДНК-полимераза I E. coli: роль в синтезе ДНК и РНК
ДНК-полимераза I E. coli состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 109 кДа и обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5'->3', 5'->3'- экзонуклеазной и 3'->5'-экзонуклеазной. Большой фрагмент ДНК- полимеразы I E. coli ( фрагмент Кленова ) является частью полипептидной цепи ДНК-полимеразы I с молекулярной массой около 76 кДа, у которой отсутствует домен, соответствующий 5'->3'- экзонуклеазе. Как ДНК-полимераза I, так и ее фрагмент используются для введения радиоактивно меченных дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем ник- трансляции, т.е. перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы двухцепочечной ДНК, в котором 3'-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов. При этом ДНК-полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5'->3'-экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5'-конца. Кроме того, фрагмент Кленова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования ДНК по методу Сенгера, заполнения 5'-выступающих "липких" концов ДНК с образованием "тупых" концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3'-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3'->5'-экзонуклеазой этого фермента.
ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ФРАГМЕНТ ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК, СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК, СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ МЕТКИ В ДНК И СПОСОБ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ
Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к биотехнологии. ДНК-полимераза получена из термофильной эубактерии Carboxydothermus hydrogenoformans или Е. coli BL21 (DE3) pUBS520pAR4 DSM 11179. ДНК-полимераза проявляет зависимую от ионов магния обратнотранскриптазную активность и 3'-5'-экзонуклеазную активность, имеет кажущуюся молекулярную массу около 100-105 кДа. Изобретение включает также рекомбинантные плазмиды и трансформированные клетки-хозяева, способные продуцировать фермент. Фрагмент выделенной ДНК с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, кодирует термостабильную ДНК-полимеразу. Фрагмент ДНК получают из Carboxydothermus hydrogenoformans. Культивируют природный штамм Carboxydothermus hydrogenoformans или Е. coli BL21 (DE3) pUBS520pAR4 DSM 11179. Клетки штамма суспендируют в буфере, разрушают клетки. Очищают выделенную ДНК-полимеразу методом хроматографии. При амплификации, введении метки и проведении обратной транскрипции используют термостабильную ДНК-полимеразу. Изобретение обеспечивает получение ДНК-полимеразы, активной при более высоких температурах, обладающей 3'-5'-полимеразной активностью и обратнотранскриптазной активностью в присутствии ионов магния и отсутствии ионов марганца. 6 с. и 2 з.п. ф-лы, 12 ил.
Ферменты, используемые в молекулярном клонировании
Рестрикционные эндонуклеазы. Основные принципы организации систем рестрикции–модификации у бактерий. Роль систем рестрикции – модификации в регуляции переноса генетической информации между бактериями. Классификация и номенклатура рестриктаз. Изошизомеры. Крупно- и мелкощепящие рестриктазы. Фрагменты с выступающими 3’- , 5’- и тупыми концами. Встречаемость тетра- и гексануклеотидов в ДНК. Лигирование фрагментов ДНК с липкими концами, образуемыми разными рестриктазами. Гибридные сайты.
Единица активности рестриктазы. Определение количества фермента, необходимого для гидролиза ДНК определенного размера и с известным числом рестрикционных сайтов. Активность рестриктазы и свойства субстрата (длина и состав оснований фланкирующих последовательностей, расположение сайтов узнавания по отношению друг к другу, структура ДНК). Специфичность рестриктаз. Снижение специфичности рестриктаз (“star-activity” - активность со звездочкой) и обуславливающие ее факторы.
Определение размеров рестрикционных фрагментов с помощью электрофореза в агарозных и полиакриламидных гелях. Конформационные формы молекул ДНК. Маркеры размеров ДНК.
Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных молекул in vitro. Сайты рестрикции как генетические маркеры. Использование рестриктаз для физического картирования, анализа полиморфизма ДНК, штаммоспецифической характеристики вирусов и бактерий, идентификации плазмид. Использование сайтов рестрикции в качестве точек отсчета при секвенировании.
ДНК- и РНК-лигазы фага Т4.
ДНК-полимеразы из различных источников; их свойства и применение.
ДНК-полимераза I из E.coli. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I. ДНК-полимераза фага Т4. Термостабильные ДНК-полимеразы. Обратные транскриптазы (РНК-зависимые ДНК-полимеразы).
РНК-полимеразы. РНК-полимеразы фагов T3, T7, SP6.
Поли (А)-полимеразы.
Дезоксирибонуклеазы. Дезоксирибонуклеаза I (панкреатическая дезоксирибонуклеаза). Нуклеаза Bal31. Нуклеаза S1. Нуклеаза из проростков золотистой фасоли. Экзонуклеазы III и VII. Экзонуклеаза фага λ.
Рибонуклеазы. Рибонуклеазы А и Т1. Рибонуклеаза H.
Другие ферменты. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфе-раза. Полинуклеотидкиназа фага Т4. Терминаза фага λ. Щелочные фосфатазы. Топоизомеразы.
Компания Novagen специализируется на производстве высокоточных полимераз и наборов для ПЦР.
Самым простым и доступным продуктом (для диагностических целей) является NovaTaq™ Hot Start ДНК полимераза. Это химически модифицированная форма Taq ДНК полимеразы, неактивная при комнатной температуре и активируемая тепловой обработкой при 95°C в течение 7-10 минут (см. инструкцию). Фермент обеспечивает лучшую специфичность при сравнении со стандартной Taq ДНК полимеразой и может минимизировать образование неспецифичных продуктов амплификации, таких как димеры и межпраймерные образования. Фермент дает ПЦР продукты с 3′-dA липкими концами, подходящими для клонирования с наборами Perfectly Blunt®, AccepTor™ и LIC Vector.
Преимущества:
• Хорошая специфичность и выход ПЦР продукта
• Наиболее точная амплификация низкокопийных фрагментов до 5 kbp
• Идеальна для качественных и высокопроизводительных методов ПЦР
KOD HiFi ДНК полимераза – это высокоточная термостабильная полимераза, амплифицирующая ДНК последовательности до 6 kbp с безупречной точностью и максимальным выходом продукта. Ферментная 3′→5′ экзонуклеазнозависимая proofreading активность приводит к более низкой частоте мутаций в ходе ПЦР, чем у других коммерчески доступных ДНК полимераз. Скорость наращивания и процессивность в 5 и в 10 - 15 раз выше соответственно, чем у Pfu ДНК полимеразы. Этот фермент позволяет получить продукты с тупыми концами, подходящие для дальнейшего клонирования с наборами Novagen Perfectly Blunt® и LIC Vector. KOD HiFi ДНК полимеразы доступны также в версии hot start для большей специфичности и длины считывания. Также доступна в качестве смеси с мутантной формы KOD HiFi, кот. лишена 3′→5′ экзонуклеазной активности. Так называемая KOD XL ДНК полимераза рекомендуется для очень длинных последовательностей
Преимущества:
Более точный ПЦР за более короткое время
Лучшая воспроизводимость чем у Pfu DNA полимеразы – превосходна для клонирования
Великолепный выход—скорость наращивания в 2 раза быстрее, чем у Taq ДНК полимеразы и в 5 раз, чем у Pfu ДНК полимеразы
Более высокая процессивность—последовательная полимеризация нуклеотидов в 10-15-раз выше, чем у Pfu и Taq ДНК полимераз
Отсутствие искаженных продуктов амплификации
KOD Hot Start ДНК полимераза - это комплекс KOD HiFi ДНК полимеразы и двух моноклональных антител, ингибирующих ДНК полимеразную и 3′→5′ экзонуклеазную активность при комнатной температуре (Mizuguchi 1999). KOD Hot Start сочетает высокую точность, высокую скорость наращивания и выдающуюся процессивность KOD HiFi с высокой специфичностью hot start, обусловленную участием антител. Неспецифическая амплификация еще меньше из-за отсутствия межпраймерных взаимодействий, обычно происходящих в результате установления и роста температуры. Кроме этого, праймеры разрушаются в процессе установки комнатной температуры благодаря эффективно ингибируемой экзонуклеазной активности. KOD Hot Start ДНК полимераза образует ПЦР продукты с тупыми концами для клонирования с наборами Novagen Perfectly Blunt® и LIC Vector.
Преимущества:
Быстрая скорость элонгации
Высокая специфичность и выход продукта
Длинное считывание - более 15 kb ДНК
Успешная амплификация трудных участков (содержание GC> 70%)
Улучшенная амплификация низкокопийной целевой ДНК
KOD XL ДНК полимераза - это оптимизированная смесь KOD HiFi ДНК полимеразы и мутантной формы KOD HiFi, кот. лишена 3′→5′ экзонуклеазной активности (Nishioka 2002). Эта смесь ферментов разработана для надежной амплификации длинных, сложных последовательностей с обильным выходом и высокой точностью. Она также может использоваться для включения производных dNTPs в ПЦР ампликоны (Sawai 2002, Sawai 2001). KOD XL ДНК полимераза образует смесь ПЦР продуктов с тупыми и липкими 3′-dA концами, подходящими для клонирования с наборами Novagen Perfectly Blunt®, AccepTor™, и LIC Vector.
Преимущества:
Идеальна для амплификации больших фрагментов DNA из очищенных и необработанных образцов
Амплификация последовательностей до более чем 30 kbp
Успешная амплификация GC-обогащенных последовательностей
Эффективно включает производные dNTPs
Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus , оптимум работы которой находится в области 70-72°С, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.
РНК-полимераза
Фермент, осуществляющий матричный синтез РНК из рибонуклеозидтрифосфатов; в зависимости от используемой матрицы - ДНК или РНК - различают ДНК-зависимую и РНК-зависимую РНК-п.; у прокариот имеется 2 типа РНК-п.: одна из них синтезирует РНК-затравки для фрагментов Оказаки, а другая - все остальные типы РНК; у эукариот - 3 типа РНК-п.: РНК-п.I осуществляет синтез рРНК, РНК-п.II синтезирует мРНК, а РНК-п.III - тРНК, 5S-РНК и др. небольшие РНК; активность РНК-п. может полностью подавляться некоторыми антибиотиками - например, рифамицином и актиномицином D (бактериальная РНК-п.), альфа-аманитином (РНК-п.II прокариот).