Virusologiya fanidan laboratoriya mashg`ulotlari ishlanmasi

1. Viruslarni mexanik usulda yuqtirish va uni optimallashtirish
Mexanik usulda virus (yoki uni RNK si) xujayraga_; barg kutikulasidagi jarohatlar (mikrotravmalar) orqali kiritiladi. Barg kutikulasida mikrojaroxatlarni diatom suvo’t lari (tselit) yoki karborund (kremniy karbidi) yoki korund (alyuminiy oksidi) kabi abrazivlarni mayda kukuni (400 -700 mesh yordamida hosil qilinadi (mesh 2,5 sm² (1 dyum) dagi poralar (teshiklar soni). Abraziv ishlatilganda inokulyatsiya effekti 20 -50 barobar oshadi, Avtoklavda yoki quritish shkaflarida sterillangan karborund, korund yoki selitii, yoki diatom tuprog’ini barg yuzasiga inokulyatsiyadaya oldinroq changlatiladi, chunki ular suvda oson cho’kadi, ammo tselit ularga qaraganda sekin cho’kmaga tushadi, shuning uchun uni inokulum bilan aralashtirib ishlatsa xam bo’ladi. Abrazivni barg sathiga changlatish uchun probirka yoki 50 ml lik xajmga ega bo’lgan kolbaga solib, uni og’zini 2 qavatli doka bilan yopib so’ngra uni changlatishda foydalanish mum kin. Inokulum bilan abrazivni aralashtirilganda uning miqdori 50-100 mg/ml bo’lishi kerak.
Inokulumdan barg satxiga 1-2 tomchi virus suspenziyasidan tomiziladi va sterillangan shisha tayyoqcha, paxta yoki doka tampon yoki yaxshilab yuvilgan va artilmay quritilgan barmoklar yordamida oxistalik bilan surtiladi. Surtishdagi kuch kattaligi bir qancha omillarga bog’liq bo’ladi: o’simlikning turi, yoshi, bargning holati, abrazivni sifati va h. Abrazyav ishlatilgandan so’ng barg so’lib qolishga moyilroq bo’lgani uchun ular qurib qolishining oldini olish maqsadida bir necha soat nam atmosferada saqlash yaxshi natijalar beradi. Virus yuqumliligini oshirish uchun Gibbs va Xarrison (1978) quyida bir qancha omillar muhimligini uqtiradilar.
a) Inokulumda ionlarning bo’lishi. Inokulumning yuqumliligi undagi yaonlar va ularnikg myaqdoriga bog’liq bo’ladi. Masalan, fosfat kontsentratsiyasi 0,02 - 0,1 M va rN
7,0 -8,5 bo’lishi virus yuqumliligini oshiradi. Yanayuqumlilik virus va xo’jayin o’simlik va ularni kombinatsiyasiga bog’ljq bo’ladi. Ko’pgina viruslarning quyi darajalarida faolligini yo’qotadi.
b) Yuqumlilik ingibitorlari. Ba’zan viruslarni sezgir o’simlikga mexanik usulda o’tkazish o’ta qiyin bo’ladi. Bunday xodisa ko’pgina o’simlik hujayrasidaga "yuqumlilikni ingibitori" bo’lib xizmat qiladigan ba’zi oqsil va polisaxaridlarga bog’liq bo’ladi. Bular virus faolligini yo’qotmaydi, ammo qandaydir yo’l bilan virus yuqishiga ta’sir qiladi. Bunday ingibitorlar qand lavlagi, Chenopodium spp. PhytolaccA o’simliklaridan ajratilgan shiralarda bo’ladi Ingibitor ta’sirini yo’qotish uchun virus kontsentratsiyasi kattaroq bo’lsa virusli o’simlik shirasini suyultirilganda, ingibitor ham suyuladi va ta’siri yo’qoladi. Yoki ingibitor ta’sirini yo’qotish uchun virusni ingibitordan tozalash kerak bo’ladi, yoki virus yuqumliligini baxolash uchun ingibitor ta’sir etmaydigan o’simlik turlari ishlatiladi. SHuning uchun, bodring, chenopodium amaranticolor, Gomphrena globosa kabi o’simliklarga ingibitorlar ta’sir etmaydi. SHuning uchun beda mozaikasi virusini Ch. Amaranticolordan Nicotiana spp ga mexanik inokulyatsiya yordamida o’tkazish qiyin, chunki CH amaranticolor ingibitorga ega. Lekin uni avval Gomphrena globosa. ga o’tkazish yaxshi natija berad.
v) Virus faolligini yo’qotuvchi moddalar. Virus yuqumliligiga yana uni faolllgini yo’qotuvchi o’simlikdaga moddalar ham ta’sir etadi. Daraxtsimon o’simliklar barglarining shiralari tanninga ega bo’lib, ular ma’lum sha-roitda viruslar bilan bog’lanib, viruslarni cho’kmaga tushiradi, natijada virus yuqumliligi yo’qoladi. Ammo bunday xolatlarning oldini olish uchun o’simlik barglarini gomogenizatsiya qilish jarayonjda rN 8 -9 ga teng bo’lgan bufer ishlatiladi va nikotin yoki kofein kabi eritmalarida eziladi. Ishqoriy muhitda tanninlarning virus bilan bog’lanishi susayadi. Boshqacha usullar ham mavjud bo’lib, bunda virus gomogenizatsiya qilinadigan muhitga birorta oqsil solinadya (masalan, kukun qiljb maydalangan teri solinadi). Bu oqsil virus bilan birga tanninni birlashtirish uchun raqobat qiladi, Bu usul "kakao shohlarini shaklini o’zgarishi virusining" bir daraxtdan ikkinchisiga o’tkazishga imkon yaratadi. Faol virus olishning yana bir usuli bu tanninga boy o’simliklardan aktiv virus olishda o’simlikni tannin miqdori kam qismidan virus ajratish dir. Masalan, gultojibarglar va yosh ildizchalarda tannin miqdori kam bo’ladi. O’simlik shiralari odatda faol oksidazalarga ega bo’lib, ularni mahsulotlari viruslar faolligini yo’qotadi. Bu holatlarni oldini olish uchun muxitga qaytargichlar (masalan, ditioreytol, merkaptoetanol, tioglikol kislotasi, tsistein solyanokisliy) yoki yoki xelatlashitiruvchi agentlar (masalan, natriy dietilditiokarbamat) solinadi.
Ba’zi "defekt" (nuqsonli) viruslarni nuklein kislotalarini muxofazasi kuchsizroq bo’ladi; bargni gomogenzatsiya qilish davrida shiradagi nukleaza va boshqa virus faolligini yo’qotuvchi agentlar virus nuklein kislotasini o’ta tez parchalab yuboradi. SHu sababli kerakli muxofaza amallarini qilinsa virus yuqumliligini qisman saqlab qolish mumkin. Jumladan, muxitga bentonit solib virus ajratish nukleazalarni bentonitga adsorbtsiya qilinishiga olib keladi yoki virusni ishqoriy (rN 9,5) muhitda ekstrakatsiya qilish ham virus nuklein kislotasi aktivligini saqlab qoladi. Virus yuqumliligini saqlashning yana bir yo’li virus ajratish vaqtida virusli o’simlik shirasini deproteinizatsiya qilishdir. Buning uchun o’simlik shirasini +2°S da suyultirilgan bufer ishlatib uni teng hajmda suvga to’yingan fenol bilan aralashtiriladi. So’ngra aralashma tsentrifuga yordamida virus nuklein kislotasiga ega "suvli fraktsiya"ni barg qoldiqlari, fenol kabi boshqa moddalardan ajratiladi.Keyin esa "suvli fraktsiya" sovitilgan dietil efirni bir necha hajmi bilan yaxshilab chayqatilib fenol qoldiqlaridan tozalanadi. Efirni yo’qotish uchun esa undan azot o’tkaziladi. SHundan so’ng preparat inoklyatsiyaga tayyor hisoblanadi. Fenol virus faolligigning yo’qotuvchi agentlarni denaturatsiya qiladi va virus nukleoproteididan virus nuklein kislotasini ajratadi va oqsil tabiatli virus yuqumliligini ingibitorlarini denaturatsiya qiladi. Yuqorida ko’rsatilgan qoidalarga roiya qilingan holda virus mexanik usulda yuqtirilganda o’simliklarda ma’lum_: muddat o’tgandan so’ng xar xil simptomlar hosil bo’ladi. O’simliqni har xil turlari virus yuqishi jarayonida tur licha ta’sirlanadi, bu ta’sirlanish o’simlikni irsiyatiga, virusni tipiga va hakozolarga bog’liq bo’ladi.