|
3.5.ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ (ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ, ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ) РЕАКЦИИ
Иммуноморфология в настоящее время представляет собой группу методов, позволяющих идентифицировать структурные компоненты in situ благодаря специфической реакции антиген-антитело, продукт которой при определенных условиях становится видимым в световом или электронном микроскопе. Существует несколько классификаций иммуноморфологических методов: по объекту исследования цитологический и гистологический, по метке антител – иммунофлюоресцентный (см. раздел 3.4.), иммуноферментный, иммуноизотопный (см. раздел 4.6.) и др.; в зависимости от выявления антигена до или после заключения ткани в заливочную среду – «пре-имбеддинг» и «пост-имбеддинг». В основу наиболее распространенной классификации положен принцип либо непосредственного взаимодействия меченного антитела с антигеном (прямой), либо опосредованного – через немеченые антитела (непрямой).
Суть иммуногистохимии (ИГХ) заключается в определении локализации антигена (опухолевого, вирусного, микробного, аутоантигена и др.) в тканях (клетках) с помощью специфических антител, т.е. в основе данного метода лежит высокоспецифическое иммунологическое взаимодействие антигена с антителом в биологических объектах. Это означает, что иммунологические реакции "переносятся" на предметное стекло морфолога. На гисто- или цитологические препараты наносят антитела к искомым антигенам. В роли такого антигена могут выступать как целые фракции (митохондриальная, ядерная и др.), так и отдельные химические соединения (белки, пептиды и др.). Комплексы «антиген-антитело» при обычной микроскопии не видны, поэтому для их визуализации используют метки. Если искомый антиген присутствует в исследуемых объектах, то образующийся комплекс антиген-антитело-метка точно укажет его локализацию. В качестве метки с антителом может быть связан либо флуорохром (краситель, дающий флуоресценцию, раздел 4.4.), либо красящий фермент (чаще всего используется пероксидаза хрена - иммунопероксидазный метод). Наиболее распространены две модификации иммунопероксидазного метода - пероксидазно-антипероксидазный (РАР-метод) и метод авидин-биотинового комплекса (ABC-метод). Популярность иммунопероксидазного метода связана, в основном, с его относительной простотой и доступностью.
Преимущества данного метода к имммунофлюоресцентному анализу определяются несколькими причинами:
1) окрашенные срезы можно наблюдать в световом микроскопе и при докрашивании ядер или цитоплазмы видна клеточная и гистологическая картина изучаемой ткани;
2) срезы, окрашенные этим методом, могут сохраняться долго, что делает возможным ретроспективный анализ результатов;
3) прорыв в области демаскировки антигенных детерминант и интенсификации иммуногистохимического окрашивания позволяет изучать срезы с парафиновых блоков, которые хранились годами;
4) прогресс в области получения моноклональных антител сделал возможным анализ экспрессии практически любого антигена;
5) в настоящий момент различными компаниями разработаны простые в использовании наборы поли- и моноклональных антител для иммуногистохимической диагностики к широкому спектру антигенов.
Прямой метод иммуномечения явился первым иммуноморфологическим подходом, основанным на непосредственном выявлении антигена в ткани с помощью меченных антител. Однако в целом же прямой метод наименее чувствителен по сравнению с остальными модификациями, однако чрезвычайно прост, поэтому его до сих пор часто используют при экспресс-анализе. В случае применения непрямого метода, первичные (специфические) немеченые антитела выявляют с помощью меченных вторичных антител к первичным антителам, выступающим по отношению к ним как антигены.
Преимущества непрямого метода по сравнению с прямым заключаются в том, что:
1) антисыворотка к первичным антителам чрезвычайно гипериммунна и обладает высоким сродством к ним;
2) с каждой молекулой первичного антитела связываются две молекулы вторичных иммуноглобулинов, в результате чего значительно повышается чувствительность метода и можно использовать первичную антисыворотку в большем разведении;
3) все первичные антитела, выработанные у одного и того же вида животного к различным антигенам, могут быть выявлены с помощью одних и тех же меченных антител. Недостатки метода– большие затраты времени и возникновение дополнительной опасности неспецифических реакций.
В настоящее время методы ИГХ незаменимы в диагностике многих заболеваний и патологических процессов, в частности, являются «золотым стандартом» в морфологической диагностике опухолей. Определение гистогенеза опухоли с помощью ИГХ основано на фундаментальных свойствах опухолевого процесса, к которым относится сохранение экспрессии функционирующих генов (для ряда белков). Это проявляется в сходстве иммунофенотипа опухолевых клеток с их нормальными клеточными аналогами (рис. 41).
В то же время данный метод незаменим и при диагностике многих инфекционных и соматических заболеваний, в том числе заболеваний печени, почек, нервной системы, мышечных дистрофий и миопатий (рис. 42). ИГХ с использованием сыворотки больных широко применяется для диагностики аутоиммунных заболеваний, когда четко определяется к каким клеткам или клеточным структурам у больного вырабатываются антитела.
Do'stlaringiz bilan baham: |
