Учебное пособие ташкент 2021 р е ц е н з е н т ы

2.3. Световая (светооптическая) микроскопия
Световая (светооптическая) микроскопия осуществляется на следующих определяющих принципах: разрешающая способность микроскопа (увеличение изучаемого объекта до 1000 раз), направление лучей освещения, свойства объекта исследования (в первую очередь проницаемость для просвечивающего пучка - прозрачность и непрозрачность). Поэтому в зависимости от особенности объекта исследования физические свойства света меняются. Меняются длина и амплитудой световой волны, а следовательно - ее цвет и яркость, трансформируются направление, фаза и плоскость распространения волны. В обычной СМ для выявления тех или иных свойств биологических объектов прибегают к их окрашиванию (рис. 25). Однако для этого клеточные и тканевые препараты должны быть фиксированными, так как воспринимают окраску определённые структурные элементы только погибших клеток. Краситель не проникает диффузно в живую клетку, не прокрашивает клеточные структуры, а обособляется в виде вакуоли в цитоплазме. Несмотря на такие ограничения,СМ позволяет проводить исследование и живых (нефиксированных) биологических объектов (витальная микроскопия). Для этих целей, например, используют тёмнопольныйконденсор (инвертированнаямикроскопия). В обычных микроскопах со стандартной оптической схемой устройства поместить емкость с культурой живых клеток между столиком и объективом не представляется возможным из-за недостаточности расстояния между ними. При инвертированной (перевернутой) микроскопии объект наблюдения освещается неснизу, а сверху, объективы же, через которые ведется наблюдение, расположены под объектом (рис.26). Всё это позволяет наблюдать за живыми (нефиксированными) клетками как бы снизу вверх непосредственно всосудах, где они культивируются, а также возникает возможность манипуляции с объектами в ходе микроскопии. Фазово-контрастнаямикроскопия, впервые описанная в 1934 году голландским физиком Ф. Цернике, является оптическим методом усиления контраста для формирования высоко четких изображений прозрачных объектов. В ее основележит дифракция луча освещающего объект,который в свою очередь меняетдлину и фазу световой волны. При этомсвет отклоняется от прямолинейного направления вблизи объекта и может заходить в область тени, формируяего визуальное изображение.(рис.27).
В медицине фазово-контрастная микроскопия применяется дляизучения живых (нефиксированных и неокрашенных) биологическихобъектов (простейших, клеток костного мозга и периферической крови,клеток культуры различных тканей и др). Основой поляризационной микроскопии является получение изображения изучаемого биологического объекта в поляризованном свете, образованном двумя лучамиво взаимно перпендикулярных плоскостях(рис. 28).
Для этих целей используют, помещенные в микроскопе между источником света и препаратом, плёнчатые поляроиды или призмы Николя. Оптически разнородные структуры по-разному меняют степень поляризации (пропускают, отражают, преломляют) лучей света. Изотропные структуры (без строгой молекулярной ориентации) пропускают поляризованный свет одинаково и независимо от плоскости поляризации. Многие же биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию и являются анизотропными. В них скорость распространения поляризованного света меняется в зависимости от направления по продольной или поперечной оси объекта. Такие свойства имеют коллагеновые волокна, реснички мерцательного эпителия, миофибриллы и др. В итоге о молекулярной организации структуры изучаемого объекта можно судить на основании сопоставления величины анизотропии и характера лучепреломления поляризованного света. Поляризационная микроскопия применима в гистологических, цитологических исследованиях, а также используется в микробиологической диагностике. Очень важно и полезно, что поляризованная микроскопия позволяет изучать нефиксированные препараты, как окрашенные, так и неокрашенные. В основе люминесцентноймикроскопии лежит уникальная способность некоторых веществ излучатьсвет после поглощения ими энергии возбуждения - люминесцировать в сине фиолетовой сегменте спектра видимого света или УФ-лучах (рис.29).
Так ряд биологических веществ, например некоторые белки, витамины,лекарственные средства обладают первичной (собственной) люминесценцией. Эта способность позволила найти применение люминесцентной микроскопии в морфологических исследованиях. Другие вещества, не обладающие собственной люминесценцией, могут выявляться при добавлении к ним специальных реагентов флюорохромов (вторичная люминесценция) (см. раздел 4.4.). Флюорохромы могут инфильтрировать клетку диффузно либо взаимодействовать избирательнос отдельными клеточные структуры и определёнными химическими соединениями. Для проведения люминесцентной микроскопии используются либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биологическим микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов. Микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты.
Источником «возбуждающего» света в люминесцентных микроскопах служатртутно-кварцевые лампы, обладающие большой поверхностной яркостью.
На пути светового потока непосредственно за кварцевой лампой помещаютспециальное стекло для защиты препарата от тепловых лучей. Комплект светофильтров позволяет выделить излучение нужной частоты, чтоповышает контрастность свечения объекта и защищает глаз исследователя от пагубного воздействия ультрафиолетовых лучей. Кроме того, предусмотрена возможность темно-польного освещения объекта ивозможность фотографирования.
В ультрафиолетовой и инфракрасной микроскопии используется способность некоторых химических веществ, входящих в состав живых клеток и микроорганизмов или фиксированных препаратов, неокрашенных и прозрачных в видимом свете, поглощать ультрафиолетовые и инфракрасные лучи определённых длин волн. Такими способностями обычно обладают высокомолекулярные соединения, например, белки, ароматические аминокислоты, нуклеиновые кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и др. С помощью УФ-микроскопии можно исследовать не только локализацию таких веществ, но и их количество, а в живых объектах – еще и их метаболизм. Инфракрасная микроскопия в медицине преимущественно нашла свое применение при исследованиях в области офтальмологии и нейроморфологии. При конструкциимикроскопов по схеме Грену изображение, формируется двумя раздельными оптическими путями, расходящимися на угол стереоскопичности. Недостатком такой системы является наклон оптической оси объективов относительно образца. Наклоненный объектив строит трапециевидное изображение объекта в фокальной плоскости окуляра. Наши глаза обычно компенсируют этот эффект, но при длительной работе наблюдатель может испытывать усталость. Преимуществом схемы Грену является высокая глубина резкости изображения, отличная стереоскопичность, а также компактность конструкции. Кроме того, изображение в каждом канале стереомикроскопа Грену формируется центрально относительно оптической системы, что позволяет легче корректировать оптические аберрации.
Стереомикроскопы Аббе выполнены с одним главным объективом, располагающимся строго перпендикулярно исследуемому объекту. Диаметр объектива накладывает некоторые ограничения на угол стереоскопичности, ограничивая его до 11 градусов. Благодаря такой схеме достигается большое поле зрение и отсутствие искажений изображения. Конструктивно стереомикроскопы с общим главным объективом сложнее, требуют высокой коррекции аберраций объектива и стоят дороже. Для специальных целей в патологии используются и другие методы СМ - интерференционнаяи др.