|
3.4. ФЛЮОРОХРОМИЯ
Флюорохромия – метод обработки микрообъектов в люминесцентной микроскопии, не обладающих природной способностью люминесцировать, специальными красителями (флюорохромами - греч. chroma -цвет, краска, «люминесцентные маркеры») с целью придания способности к люминесценции, увеличения силы и контрастности свечения (см.раздел 2.1.1.). При искусственном введении флюорохромы адсорбируются клетками и тканями, придают им способность люминесцировать (вторичная люминесценция). Возбуждение люминесценции микроскопических объектов окрашенных Ф., производится ультрафиолетовым, фиолетовым и синим светом. Флюорохромами являются красители (ауромин, корифосфин и др.), пигменты и их производные (хлорофилл, порфирины), некоторые алколоиды (берберин) и др. Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно, либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано применение люминесцентной микроскопии при цитологических и гистологических исследованиях, поскольку метод дает преимущество в идентификации деталей морфологических структур по сравнению с обычным окрашиванием (в особенности, биологических объектов). Благодаря большой чувствительности люминесцентной микроскопии концентрация флюорохрома может быть очень малой, что позволяет производить наблюдение и на живых биологических объектах (прижизненное флюорохромирование) и исследовать происходящие в них процессы обмена веществ.
Наибольший интерес представляет акридин оранжевый (рис. 39), который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. При этом ДНК ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а РНК - рубиново-красным. Акридиновый оранжевый, кроме того, применяют в комплексной диагностике злокачественных опухолей в цитологических и гистологических препаратах. На различной способности воспринимать флуоресцирующий краситель ишемизированными и нормальными тканями основано, например, применение метода в диагностике ранних сроков инфаркта миокарда.
Существуют специальные флюорохромы для выявления некоторых химических веществ в объектах:
– корифосфин применяют для выявления кислых мукополисахаридов;
– кофеин 5 и родамин могут быть использованы для определения гликогена;
– фосфин ЗР применяют для определения липидов;
– тиофлавин окрашивает амилоид (зеленая люминесценция);
– с помощью раствора раморина в спирте определяют кальций в тканях (зеленая люминесценция);
– при обработке препаратов раствором солохрома черного удается выявить алюминий (жёлто-оранжевая люминесценция);
– с помощью рол амина 6G в лёгких определяют сурфактант (оранжевая люминесценция).
Иммунофлюорохромия (метод флюоресцирующих антител (МФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ)) заключается в визуализации реакции антиген-антитело люминесцентными маркерами (метод качественного и количественного определения антигена по известному иммуноглобулину или антитела по известному антигену). Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А.Кунсом. Различают прямой МФА и непрямой МФА с комплементом.
При помощи иммунофлюоресценции в соответствующем микроскопе можно выявлять наличие различных антигенов в клетках и тканях, а также оценивать их концентрацию. Это служит целям идентификации вирусов, определения антител и иммунных комплексов, гормонов, ферментов, различных метаболитов и др. Поэтому люминесцентную микроскопию можно применять в диагностике герпеса, эпидемического паротита, вирусных гепатитов, гриппа и других вирусных инфекций. Метод используется в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя мазки-отпечатки слизистой оболочки верхних дыхательных путей, в том числе при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии люминесцентная микроскопия с использованием антител, меченных флюорохромами, позволяет идентифицировать некоторые иммунопатологические процессы, опухоли, амилоид (рис. 40). Недостатками всех видов МФА является ограниченная чувствительность по причине возможных перекрестных реакций между объектами, имеющими близкий антигенный состав. Кроме того, негативное влияние может оказать неспецифическая флюоресценция вследствие адсорбции флюоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата.
Do'stlaringiz bilan baham: |
