Учебная литература медицинских вузов для студентов

Тема 8.3. МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
План
Программа
Особенности и основные понятия экологии микроор­ганизмов.
Качественные и количественные методы изучения со­става микрофлоры отдельных биотопов.
Значение нормальной микрофлоры в жизни человека.
Микробиологическое исследование при дисбактериозе.
а Демонстрация
Окрашенные мазки, приготовление из чистых культур бактерий, представителей облигатной микрофлоры че­ловека. Рост на скошенном агаре E.coli, Proteus vulgaris,
Staphylococcus epidermidis.
Микрофлора зубного налета.
Задание студентам
1. Приготовить мазки из зубного налета, микроскопиро-вать и зарисовать; сделать заключение.

кровяной агар, для выделения E.coli— на среду Эндо, для вы­деления дрожжеподобных грибов рода Candida — на среду Са-буро. Посевы производят таким образом, чтобы получить со­считываемое количество колоний. Такие исследования повто­ряют через определенные сроки, чтобы сделать заключение о количественных изменениях состава микрофлоры в динамике заболевания (табл. 8.3.1).

Таблица 8.3.1. Состав нормальной, резидентной микрофлоры биото­пов организма человека

Микрофлора биотопа
Ориентировочное содержание микробов

Кровь, лимфа, внутренние органы, головной и спинной мозг, спинномозговая жидкость
г—сравнительно часто встречаются: i Vaphylococcus epidermidis \saprophyticus (+) А пеЬас1епит spp. (+) А rtococcus spp. (+) А Г/Ля fo. (+) А зрр. А mas aeruginosa (-) А
1ечный тракт ^благоприятные условия для
йикрофлоры:
ъиз salivarius,
mitis, S. mutatis, S.sanguis (+) A Lactobacillus spp. (+) ah Bifidobacterium spp. (+) ah Leptotrichia buccalis (—) Veilonella spp. (—) ah Bacteroides spp. (-) ah Candida spp. A Treponema skoliodontum, T.denticola (—) A Neissena spp. (-) A Mycoplasma spp. A Staphylococcus spp. (+) A
Желудок — многие микроорганизмы погиба­ют при кислом значении рН, встречаются:
Sarcina ventriculi (+) А
Lactobacillus spp. (+) А
Candida spp. A
Тонкая кишка — в верхних отделах кишки микрофлора представлена скудно в связи с активностью ферментов. Число микроорга­низмов постепенно нарастает в илеоцекальном отделе
В норме не содержат микробов и являются стерильными
10²-10⁴ на 1 см³
10⁸ в 1 мл слюны
Не более 10³ в 1 мл содержимого
Около 10⁵ в 1 мл со­держимого
Продолжение

Микрофлора биотопа
Ориентировочное содержание микробов

Толстая кишка — благоприятные условия для 10¹⁰ в 1 г фекалий
разнообразной микрофлоры, выделяются с
фекалиями:
Анаэробы (в совокупности)
Bacteroides spp. (—)
Bifidobacterium spp. (+)
Lactobacillus spp. (+)
Clostridium spp. (+)
Veilonella spp. (—)
Аэробы
E.coli и др. энтеробактерии (—)
Streptococcus faecalis (+)
Bacillus spp. (+)
Конъюнктива глаза — очень часто микроор­ганизмы полностью отсутствуют, могут встре­чаться:
Staphylococcus epidermidis (+) А
Corynebacterium spp. (+) А
Уши (наружный слуховой проход) — факуль­тативно встречаются:
Staphylococcus epidermidis (+) А
Corynebacterium spp. (+) А
Candida spp. A
Дыхательная система (верхние дыхательные пути)
Staphylococcus saprophyticus (+) А
Streptococcus spp. (+) А
Klebsiella spp. (—) A
Neisseria catarralis (-) A
Candida spp. и др.
Мелкие бронхи, альвеолы и паренхима легких обычно не содержат микробов Мочеполовая система
Число микробов в со­вокупности составля­ет 10¹⁰ в 1 мл влага­лищного секрета. Со­отношение анаэробов к аэробам 10:1
Стерильна
Женские половые органы (влагалище и шей­ка матки)
Lactobacillus spp. (+) ан
Corynebacterium spp.
(+)Ан
Peptococcus spp.
Полость матки —
Мужские половые органы
Mycobacterium smegmatis (+) А
Corynebacterium spp. (+) А
Staphylococcus epidermidis (+) A
и др.

Микрофлора биотопа Ориентировочное содержание микробов Дистальная треть уретры (женщин и муж­чин) Peptostreptococcus spp. (+) ан Peptococcus spp. (+) ан Corynebacterium spp, (+) A Mycoplasma hominis A Staphylococcus epidermidis (+) A Моча в почках, мочеточниках и мочевом пу- Стерильна зыре При естественном мочеиспускании микробы Число микробов не попадают в мочу с наружного участка уретры должно превышать 10^3 КОЕ/мл

Бактериологическое исследование трупов павших жи­вотных.
Методы изучения факторов вирулентности бактерий:
а) изучение взаимодействия лиганд-рецепторного ап­парата;
б) определение токсигенности микробов;
в) определение ферментов патогенности.
5. Особенности вирусных инфекций.
а Демонстрация
Капсула патогенных бактерий; окраска по методу Бурри—Гинса.
Корд-фактор Mycobacterium tuberculosis (метод Прайса); окраска по методу Циля—Нильсена.
а Задание студентам
Зарисовать демонстрируемые препараты: а) капсулу патогенных бактерий; б) корд-фактор М.tuberculosis.
Микроскопировать и зарисовать окрашенные метиленовым синим мазки-отпечатки из органов белой мы­ши, павшей после заражения культурой патогенных
бактерий. Определить присутствие бактерий во внут­ренних органах и тканях. Сделать заключение о форме инфекции и возможных причинах гибели животного.
Микроскопировать мазок со слизистой оболочки, ок­рашенный по методу Романовского—Гимзы. Найти и зарисовать "ключевые" клетки, покрытые адгезированными бактериями.
Микроскопировать и зарисовать мазок, демонстрирующий явление незавершенного фагоцитоза гонококков; окраска по методу Грама.
Учесть результаты опытов, поставленных с целью вы­явления факторов вирулентности стафилококков: ге­молизина, лецитиназы, плазмокоагулазы.
Определить гемолитическую активность бактериаль­ного экзотоксина (О-стрептолизина).
а Методические указания
Бактериоскопические методы выявления факторов вирулент­ности. Обнаружение капсулы у стрептококков (см. тему 2.2).
Выявление корд-фактора микобактерий. При выра­щивании микобактерий на предметных стеклах, погруженных в жидкую среду на основе цитратной крови, вирулентные штаммы вырастают в виде переплетающихся тяжей — корд-фактор. Для их обнаружения стекла окрашивают по методу Циля—Нильсена (см. рис. 14.3.2).
Выявление адгезии бактерий. При некоторых инфек­циях бактерии в большом количестве прикрепляются к мембране эпителиальных клеток. Обнаружить это явление можно с помощью микроскопических методов в мазках со слизистой оболочки пораженного органа, окрашенных по методу Рома­новского— Гимзы. Такие клетки получили название ключевых.
Выявление незавершенного фагоцитоза (см. рис. 15.2.1). При микроскопии наблюдается большое количество неразрушенных микроорганизмов, расположенных внутри про­фессиональных фагоцитов.
Определение экзоферментов и экзотоксинов — факторов па-тогенности. Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кис­лоту, которая перестает образовывать сгусток при добавлении уксусной кислоты. Для определения этого фермента в пробир­ку с субстратом (гиалуроновой кислотой) вносят суточную культуру бактерий или фильтрат бульонной культуры и инку­бируют в течение 15 мин при 37 °С. Затем добавляют 2—3 капли концентрированной уксусной кислоты. В пробах, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования сгустка.
Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в 0,4 мл стерильной цитратной плазмы крови. Посе­вы ингибируют при 37 °С в течение 2—5 ч. В случае выработки фермента происходит свертывание плазмы, а в контроле она остается жидкой.
Гемолизин определяют путем посева испытуемой куль­туры "бляшками" в чашки Петри с кровяным агаром. Чашки инкубируют в термостате при 37 °С в течение суток. В поло­жительном случае вокруг "бляшек" образуются прозрачные зоны гемолиза.
Определение титра гемолитической активности бактериального экзотоксина (0-стрептолизина). Из фильтрата бульонной культуры р-гемолитического стрептокок­ка готовят ряд двукратных серийных разведений. К каждому из них добавляют равный объем 5 % взвеси отмытых эритро­цитов кролика. Смесь инкубируют в термостате при темпера­туре 37 °С в течение 1 ч. Параллельно инкубируют контроль­ную взвесь эритроцитов в питательном бульоне того же соста­ва. Учет результатов производят по наличию гемолиза (крас­ная, прозрачная "лаковая" кровь) или отсутствию гемолиза (осадок эритроцитов). Определяют наибольшее разведение (титр) фильтрата бульонной культуры стрептококка, при кото­ром еще наблюдается гемолиз. В дальнейшем этим разведением пользуются при определении рабочей дозы О-стрептолизина для постановки антистрептолизиновой реакции.
Лецитиназа выявляется при посеве на агар с лецитином. Вокруг колоний бактерий, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском.
Лецитиназная проба: для быстрого обнаружения и се­рологической идентификации а-токсина клостридий — возбу­дителей газовой гангрены — в раневом отделяемом определяют его лецитиназную активность в реакции нейтрализации с анти­сыворотками против токсинов клостридий разных видов (см. табл. 12.2.2). С этой целью исследуемый материал (раневое отделяемое) помещают в пробирки с раствором лецитина и добавляют антисыворотки. Присутствие лецитиназы в раневом отделяемом проявляется помутнением жидкости в пробирке. При нейтрализации лецитиназной активности токсина соот­ветствующей антисывороткой жидкость остается прозрачной. Цитотоксины. Для обнаружения некоторых бактериаль­ных токсинов, оказывающих цитопатическое действие на клет­ки (ЦПД), используют клеточные культуры. Бактерии выращи­вают в бульоне. Затем питательную среду отделяют от микро­бов и вносят в культуру чувствительных клеток. В положитель­ном случае после инкубации наблюдается характерное ЦПД. Бактериальные токсины различаются по характеру ЦПД, ко­торое может проявляться изменением формы, размеров клетки, появлением вакуолей в цитоплазме, нарушением целостности клеточного монослоя и т.д.
Методы определения вирулентности бактерий и активности бактериальных токсинов на экспериментальных животных
Экспериментальное заражение животных. Инфек­ционный процесс может быть искусственно воспроизведен пу­тем заражения лабораторных животных: кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др. Это производится для изучения патогенности и вирулентности микроорганизмов, вы­деления чистой культуры возбудителя из различных материалов (метод биопробы), воспроизведения экспериментальной ин­фекции и других целей.
Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально, интратрахеально и интрацеребрально. Все ма­нипуляции осуществляют с помощью стерильных инструмен­тов. Перед началом опыта животных отбирают, взвешивают и маркируют. Мышь берут за хвост, опускают на стол, туловище быстро прижимают к столу двумя пальцами и, скользя ими по спине, захватывают кожу над головой и фиксируют животное в левой руке в растянутом положении. Взвесь микроорганиз­мов определенной концентрации набирают в шприц через иг­лу. Шприц держат как писчее перо в правой руке. При под­кожном заражении иглой прокалывают кожную складку на спине или у корня хвоста и медленно вводят содержимое шприца под кожу. Затем иглу быстро извлекают, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом. При внутрибрю-шинном заражении животное фиксируют головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи, удерживая иглу под острым уг-




пипетки выдувают в пробирку со средой. Из ткани легких готовят мазки-отпечатки и делают посевы.
Брюшную полость вскрывают продольным разрезом брю­шины ножницами, не задевая кишечник. Осматривают органы брюшной полости, отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и консистенцию печени, селезенки, надпочеч­ников, брыжеечных лимфатических узлов. При необходимости делают посевы из этих органов на питательные среды.
Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют в жидком фиксаторе и окраши­вают метиленовым синим. При микроскопии отмечают при­сутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях. Результаты посевов учитывают на следующий день после ин­кубации в термостате. Данные вскрытия трупа протоколируют. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению.