Тема 22.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ОНКОГЕННЫМИ ВИРУСАМИ ЧЕЛОВЕКА И ВИРУСАМИ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА План Программа Биологические свойства онкогенных вирусов. Вирусные и клеточные онкогены и антионкогены. Роль онкогенных вирусов в патогенезе злокачественных но вообразований человека.
Биологические свойства ВИЧ. Экология ВИЧ и эпидемиология ВИЧ-инфекции, группы риска. Патогенез, диагностика, принципы профилактики и лечения ВИЧ/СПИД. СПИД-ассоциированные оппортунисти ческие инфекции.
а Задание студентам
Ознакомиться с бланками направлений на исследование в вирусологическую лабораторию.
Указать материал для диагностики ВИЧ-инфекции.
Ознакомиться с тест-системами для серодиагностики ВИЧ-инфекции.
Оценить результаты серодиагностики ВИЧ-инфекции методом ИФА и наметить план дальнейшего обследования.
а Методические указания
• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных HPV
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазок-соскоб или биоптат из пораженного участка кожи или слизистой оболочки.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Цитологический метод — обнаружение измененных клеток с признаками ЦПД (коилоциты).
Вирусоскопический метод — обнаружение зрелых вирусных частиц в зараженных клетках. Этот метод позволяет обнаружить вирусы только в случае их репродукции. В опухолевых клетках присутствуют дефектные вирусы, не способные к репродукции.
Вирусологический метод — не применяют в связи со сложностью культивирования вируса.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические исследования. Обнаружение вирусных антигенов в зараженных клетках методом ИФ.
Молекулярно-биологические исследования. Обнаружение вирусных ДНК в зараженных клетках — метод ДНК-зондов (ДНК-гибридизация in situ), ПЦР. Эти методы позволяют диагностировать латентную инфекцию и присутствие дефектных вирусов.
Серодиагностика. С целью диагностики ЯРК-инфекции выявляют антитела к белкам капсида и вирусным онкогенам.
• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных BKV
и /СУ (см. главу 21 и главу 19 соответственно)
• Диагностика инфекций, вызванных HTLV
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Серодиагностика — обнаружение антител к вирусным белкам — применяют для выявления вирусоносительства и лабораторной диагностики тропического спастического паралича (см. также главу 19).
• Микробиологическая диагностика ВИЧ-инфекции
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, лейкоциты периферической крови, пунктах лимфатических узлов и костного мозга. Вирус также может быть обнаружен в отделяемом слизистых оболочек генитального тракта, сперме, слюне, слезной жидкости, грудном молоке, спинномозговой жидкости, в трупном материале.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Вирусологический метод (схема 22.1.1). Выделение вируса из крови и лейкоцитов в связи со сложностью культивирования в клинической практике используется редко. Основным показанием к применению является раннее обнаружение вируса у новорожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Вирус выделяют путем совместного культивирования мононуклеарных лейкоцитов периферической крови пациента с лейкоцитами здоровых доноров в присутствии IL-2 для стимуляции роста Т-лимфоцитов. ЦПД проявляется образованием синцития и лизисом зараженных клеток. Метод позволяет выявить латентную инфекцию. О присутствии вируса судят по результатам определения специфических антигенов ВИЧ (р24, обратной транскриптазы) в культуральной среде и зараженных клетках. Культивирование ВИЧ требует соблюдения специальных условий безопасности при работе.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические исследования. Обнаружение вирусных антигенов (р24) в крови и лимфоцитах с помощью ИФА. Следует учитывать, что р24 в достаточном для выявления количестве присутствует в крови только при первичной инфекции и на поздних стадиях заболевания.
Молекулярно-биологические исследования. Обнаружение РНК вирусов в крови методом RT-ПЦР. Метод основан на преобразовании вирусной РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием фермента обратной транскриптазы (RT) и амплификации полученной кДНК методом ПЦР — применяется для определения уровня вирусемии. Чувствительность метода позволяет обнаруживать вирус в малых концентрациях.
Серодиагностика. Обнаружение антител к вирусным антигенам (поверхностным белкам gp!20) — методы ИФА — применяют для массового обследования. В случае положительного результата с целью верификации осуществляют поиск антител к индивидуальным вирусным белкам методом иммуноблоттин-га, непрямой ИФ и другими методами.
Метод иммуноблоттинга ("вестерн-блот") — тестирование сыворотки на наличие антител против отдельных вирусных антигенов сердцевины и поверхностной оболочки ВИЧ. Вирусные белки с помощью электрофореза в вертикальном блоке полиакриламидного геля разделяют по молекулярной массе и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, где антитела сыворотки реагируют с индивидуальными вирусными белками. Образующиеся иммунные комплексы выявляются авторадио-графически или с помощью ИФА.
Для косвенного подтверждения диагноза СПИД могут быть использованы методы оценки иммунного статуса: определение общего количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, соотношения CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов, количества натуральных киллеров, уровней сывороточных иммуноглобулинов. Для СПИД характерно развитие Т-клеточного дефицита: снижение количества Т-лимфоцитов, преимущественно Т-хелперов CD4+ (менее 500/мм3), снижение уровня показателя CD4+/CD8+ ниже 1,0; уменьшение количества натуральных киллеров; умеренная поликлональная гипергаммаглобулинемия с увеличением содержания IgG.
• Диагностические, профилактические и лечебные препараты
Тест-системы для диагностики ВИЧ/СПИД методом ПЦР.
Тест-системы для серодиагностики ВИЧ/СПИД методом ИФА.
Тест-системы для диагностики папилломавирусной инфекции методом ПЦР.
Противовирусные препараты:
Ингибиторы обратной транскриптазы: азидотимидин (AZT), ди-дезоксиинозин (DDI), дидезоксицитидин (DDC), невирапин и др.
Ингибиторы протеазы: саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир и др.
Препараты для иммунотерапии: интерферон человеческий лейкоцитарный; интерферон рекомбинантный.
