Учебная литература медицинских вузов для студентов

Тема 5.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ И ДРУГИХ ОБЛИГАТНЬГХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАЗИТОВ (РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ)
Введение. Вирусы не имеют собственного метаболизма. Для репродукции они используют метаболические системы клетки-хозяина.
Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой.
Продуктивная инфекция. При этой форме инфек­ции в клетке происходит репродукция вируса и образуется вирусное потомство — 10⁴—10^ вирусных частиц, которые вы­
ходят из зараженной клетки во внешнюю среду.
Интегративная инфекция. Геном вируса встраива­ется (интегрирует) в геном клетки-хозяина. Интегрированные вирусные геномы — провирусы — передаются потомству зара­женной клетки при делении. РНК-содержащие вирусы также могут вызвать интегративную нфекцию путем обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы
(обратной транскриптазы). При этом в клеточный геном встра­ивается образующаяся ДНК-копия вирусной РНК. При опре­деленных условиях интегративная форма вирусной инфекции
может переходить в продуктивную.
Абортивная инфекция. При проникновении в клетку дефектного вируса, не способного к самостоятельной репро­дукции, или при попадании полноценного вируса в непермис-
сивную (не подходящую для его репродукции) клетку, или при неподходящих условиях внешней среды возникает абортивная форма инфекции. Взаимодействие с клеткой прерывается на одной из ранних стадий — вирус не репродуцируется и не передается потомству зараженной клетки.
План
Программа
Методы культивирования вирусов, риккетсий, хламидий.
Методы индикации вирусов.
Бактериофаги: морфология и физиология, практичес­кое применение.
Демонстрация
Питательные среды, растворы и лабораторная посуда для культур клеток.
Культуры клеток: незараженные, зараженные вирусом простого герпеса и хламидиями. Отметить изменения в культурах клеток, зарисовать, сделать вывод.
Задание студентам
1. Учесть результаты реакции гемагглютинации (РГА), поставленной для выявления гемагглютинирующего
вируса в материале из куриного эмбриона, и опреде­лить титр вируса.
Учесть результаты индикации вируса в культуре кле­ток по цветной пробе.
Учесть результат титрования бактериофага по методу Грациа.
Определить спектр литического действия бактерио­фага.
Ознакомиться с методом фаготипирования бактери­альных культур. Определить фаговары культур стафи­лококков, выделенных от больных.
Ознакомиться с препаратами бактериофагов, классифицировать по назначению.
а Методические указания
Методы культивирования вирусов. Для культивирования ви­русов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чув­ствительных лабораторных животных. Эти же методы приме­няют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на ис­кусственных питательных средах.
Культуры клеток. Представляют собой соматические или эмбриональные клетки животных или человека, культиви­руемые в лабораторных условиях. Клеточные культуры разли­чаются по источнику получения, способности к размножению in vitro и кариотипу. Их подразделяют на первичные (непере­виваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Первичные культуры клеток получают непосредственно из тканей многоклеточных организмов. Такие клетки обычно не способны к делению (неперевиваемые) и используются одно­кратно.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клет­ки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 20—50 пассажей (пересе­вов) — до года — диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки при культивировании не претерпевают злокачественного пере­рождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Перевиваемые культуры клеток готовят из злокачественных линий клеток, обладающих способностью неограниченно раз­множаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся, например, злокачественные клетки HeLa, первоначально вы­деленные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы) и др.
Для выращивания клеточных культур используют питатель­ные среды сложного состава, включающие источники энергии, минеральные вещества, аминокислоты, витамины и другие
факторы роста. Клетки чрезвычайно чувствительны к измене­нию рН среды. Для контроля рН в среды добавляют индикатор. Большинство клеточных культур растет в виде монослоя (плас­та, состоящего из одного слоя клеток), прочно прикрепляясь к поверхности контейнера для культивирования — пробирки, пластикового планшета или матраса (флакон 4-гранной фор­мы). Некоторые типы клеток способны расти также в суспен­зии.
Приготовление первичной культуры клеток включает не­сколько последовательных этапов: измельчение ткани, разъ­единение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост (например, в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови). При оседании клетки довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде монослоя. После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток ее заражают мате­риалом, содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упо­мянутые микробы проникают внутрь клеток, где и размножа­ются. В культурах клеток удается культивировать большинство вирусов, вызывающих заболевания человека.
Внутриклеточные паразиты оказывают цитопатическое дей­ствие (ЦПД) на клетки, в которых происходит их репродукция. ЦПД может проявляться деструкцией (лизисом) зараженных клеток, изменением их морфологии (изменением размеров и формы самой клетки, клеточного ядра, появлением вакуолей или включений, представляющих собой внутриклеточные скопления вирусов, образованием синцития) и нарушением их функций.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминиро-ваны вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнитель­но высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Они пригодны для культивирования хламидии, риккетсии и некоторых вирусов, патогенных для человека.
Для получения чистых культур риккетсии, хламидии и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) исполь­зуют 8—12-дневные куриные эмбрионы. К недостаткам данно­го метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие большого количества белков и других соедине­ний, затрудняющих последующую очистку возбудителя при изготовлении различных препаратов.
Для заражения куриных эмбрионов исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку или в желточный мешок куриного

культивирования облигатных внутриклеточных паразитов в ор­ганизме лабораторных животных перед другими состоит в воз­можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуци­руются в культуре клеток или эмбрионе. К его недостаткам относятся высокая вероятность контаминации организма по­допытных животных посторонними вирусами и мико плазмами, а также необходимость последующего заражения культуры кле­ток для получения чистой культуры данного вируса, что уве­личивает сроки исследования.

Методы индикации вирусов. Для демонстрации при­сутствия вируса в клеточной культуре используют несколько методов.
I. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически по морфологическим из­менениям клеток. Часть таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплош­ного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточ­ные островки. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовиру-сы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация кле­ток (рис. 5.2.2) и т.д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая культуру клеток под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом. Не­которые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4—6-й день). Характер ЦПД используют как для обнаружения вирусов (индикации), так и ориентировочной идентификации, т.е. оп­ределения их видовой принадлежности.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Форма включений различна, а размеры колеблются от 0,25 до 25 мкм. Они представляют собой места скопления вирусных частиц и могут быть выявлены в препара­тах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных по методу Романовского—Гимзы или флюорохромами. В послед­нем случае используют люминесцентную микроскопию.
В клетках, пораженных риккетсиями, на 3—8-й день отме­чается большое количество коккобациллярных форм, целиком заполняющих цитоплазму или ядро клеток, которые затем гиб­нут. Хламидии также рассматривают в окрашенных по методу Романовского—Гимзы препаратах клеток, в которых образуют­ся цитоплазматические включения, представляющие собой внутриклеточные микроколонии этих бактерий.

способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется.
П. Реакцию гемадсорбции применяют для индикации гемаг-глютинирующих вирусов. Реакция основана на способности поверхности клеток, в которых репродуцируются такие вирусы, адсорбировать эритроциты. Для постановки реакции гемад­сорбции в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клет­ки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилип­шие эритроциты.
III. Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обна­ружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жид­кости зараженной культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглюти-нацию — "склеивание" эритроцитов разных видов животных (кур, гусей, морских свинок) — вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин. Для постановки реакции гемагглюти­нации к исследуемому материалу добавляют взвесь эритроцитов. В присутствии вирусов происходит агглютинация эритроцитов.
После вскрытия куриного эмбриона аллантоисную жид­кость отсасывают и разливают по 0,5 мл в пробирки или лунки плексигласовой пластины (для контроля берут 0,5 мл такой же жидкости незараженного эмбриона). Затем добавляют по 0,2 мл 1 % суспензии отмытых куриных эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают через 40 мин после оседания эритроцитов: (++++) — выражен­ная гемагглютинация — тонкая пленка склеившихся эритроци­тов на дне пробирки, имеющая вид зонтика, (+++) — наличие просветов в пленке, (++) — наличие пленки с фестончатыми краями из склеившихся эритроцитов, (+) — хлопьевидный оса­док эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютиниро­ванных эритроцитов, (—) — резко очерченный осадок эритро­цитов, неотличимый от контроля. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контрольных указы­вает на содержание вируса в исследуемой жидкости. Для оп­ределения титра РГА ставят реакцию с разведениями вируссо-держащей жидкости 10~V 10~², 10~³ и т.д. За титр РГА при­нимают максимальное разведение, при котором наблюдается гемагглютинация (++). Титр РГА характеризует активность вируса и используется при постановке РТГА (см. тему 10.2).
Для количественного обнаружения вирусных частиц ис­пользуют методы титрования. Титр вируса можно определить в реакции гемагглютинации с 10-кратными разведениями куль­туральной среды, или материала из куриного эмбриона, или по ЦПД в культуре клеток. В последнем случае клетки культуры заражают 10-кратными разведениями материала, содержащего вирус. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на

отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые могут поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаготипов (фагова-ров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются фаги, лизи-рующие родственные виды бактерий. В практической работе фаги применяют для:

фаготипирования бактерий, т.е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, что важно для маркировки исследуемых
бактерий при эпидемиологическом анализе заболеваний;
фагоидентификации бактериальных культур с целью ус­тановления их видовой принадлежности;
фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвен­но свидетельствует о наличии в материале соответствующих
бактерий;
фагопрофилактики — предупреждения некоторых заболе­ваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпи­демическом очаге;
фаготерапии — лечения некоторых инфекционных забо­леваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафило­кокком.