Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Создание и изучение клеточных линий с CRISPR/Cas9-направленным 
нокаутом индивидуальных генов для повышенной продукции вируса гриппа
Степанов Г.А.
1
, Сергеева М.В.
1,2
, Можаева Е.В.
1
, Ещенко Н.В.
1
, Васильева А.Д.
1,2
, 
Медведев С.П.
1,3
, Малахова А.А.
1,3
, Васильев К.A.
2
, Шурыгина А.-П.С.
2
, Семенов Д.В.
1
, 
Журавлев Е.С.
1
, Балахонова Е.А.
1
, Маланин С.Ю.
4
, Григорьева Т.В.
4
, Рихтер В.А.
1
, 
Комиссаров А.Б.
1,2
1
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия 
2
Научно-исследовательский институт гриппа Минздрава России,
Санкт-Петербург, Россия 
3
ФИЦ «Институт цитологии и генетики СО РАН», Новосибирск, Россия 
4
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Вакцинопрофилактика является наиболее рациональной стратегией борьбы с эпи- 
демиями гриппа. В настоящее время существует очевидная потребность в разработке 
более технологичных платформ производства вакцин. Перспективным направлением 
является создание клеточных линий человеческого происхождения, обеспечивающих 
повышенную репликацию вируса гриппа с максимальным сохранением антигенных 
свойств. Решение проблемы увеличения пермиссивности клеточных культур путем 
выключения определенных генов-мишеней методами геномной инженерии положит 
начало рациональному дизайну линий, чувствительных к заданным патогенам, 
существенно увеличит эффективность выделения вирусов и обеспечит производство 
культуральных вакцин стандартизованным субстратом.
В работе проводили нокаут генов-мишеней с помощью внесения точечных разрывов 
системой CRISPR/Cas9. Были получены моноклональные клеточные линии с нокаутом 
генов AnxA6 и IRF-7 за счет мутаций, обеспечивающих сдвиг рамки считывания. Далее 
оценивали уровень накопления вирусных компонентов в клетках модифицированных 
и исходной линий и показали достоверное увеличение эффективности репликации 
вируса. Методом титрования на клеточной культуре MDCK были получены ключевые 
результаты, демонстрирующие повышение уровня накопления инфекционно-активного 
вируса гриппа в линиях ANXA6-/- и IRF7-/- по сравнению с исходной линией 293FT. 
Полученный результат подтверждали независимыми методами оценки уровня вирусной 
РНК и вирусного белка NP в зараженных клетках. Для выявления молекулярных путей, 
обеспечивающих наблюдаемые эффекты, проводили транскриптомный анализ (Illumina 
RNA-Seq) изменений в уровне экспрессии генов в модифицированных линиях в условиях 
заражения вирусом гриппа А. Изменения в уровне и структуре мРНК генов-мишеней 
были подтверждены данными массового параллельного секвенирования.
Таким образом, была продемонстрирована возможность повышения продуктив-
ности наработки вируса гриппа в клеточной линии человеческого происхождения путем 
направленного нокаута даже единичных генов. Индивидуальный нокаут выбранных 
генов-мишеней является первым этапом конструирования высокопермиссивной 
клеточной культуры для наработки широкого набора штаммов вирусов гриппа.
Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда №18-75-10069.

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
216