Сборник материалов всероссийской научно-практической конференции с международным участием

Методика иммуногистохимической визуализации
фитогормонов
 
Растительный материал (бутоны петунии) фиксировали в смеси 4% 
параформальдегида, пропионовой кислоты и 70% этилового спирта в соотношении 5: 5: 
90 (V/V) c добавлением 2% (m/V) 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид 
гидрохлорида в течение 24 ч при 4ºC (Chen and Zhao 2008). Затем фиксированный 
материал проводили через серию спиртов (96% - абсолютный спирт), парафинизировали и 
получали полутонкие гистологические срезы. Последние наклеивали на предметные 
стекла и проводили депарафинизацию. Затем препараты проводили через серию спиртов 
(70% - 50% - 30% - 15%) и помещали в 10 мМ фосфатный буфер (PBS), содержащий 0,1% 

---

43 
(V/V) Tween 20, 1.5% глицина и 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) сначала на 
20 мин, затем на 40 мин при 22ºC. Далее образцы были промывали в нормальном солевом 
буфере (НСБ) (10 мМ PBS, 0.8% NaCl, 0.1% (V /V) Tween 20 и 0.8% БСА), а затем три раза 
в том же буфере без NaCl и Tween 20.
Инкубацию образцов с анти-антителами (моноклональные анти-ИУК 
продуцируемые в мыши, A0855-200UL, Sigma; разведение 1:1000) проводили в PBS + 
БСА (0,1%) в течение ночи при комнатной температуре во влажной камере в темноте. 
После инкубации образцы несколько раз тщательно промывали в концентрированном 
солевом буфере (КСБ), содержащим 10 мМ PBS, 2.9% NaCl, 0.1% (V/V) Tween 20 и 0.1% 
БСА с последующей промывкой в НСБ и буфере без NaCl и Tween 20. Затем проводили 
инкубацию образцов со вторичными антителами (анти-мышиные продуцируемые в козе 
LGG FITC-конъюгированные, F5383-5ML, Sigma; разведение 1:100) в PBS + 0.1% БСА в 
течение 4 ч при вышеуказанных условиях. После этого образцы несколько раз тщательно 
промывали в КСБ с последующей промывкой в НСБ и буфере без NaCl и Tween 20, как 
описано выше.
Инкубация с анти-АБК антителами (поликлональные анти-АБК продуцируемые в 
кролике, AS09446, Agrisera; разведение 1:200) была проведена в соответствии с тем же, 
выше условиями. После конъюгаций образцы снова тщательно промывали, как описано 
выше. Инкубация с вторичными антителами (анти-кроличьи продуцирцемые в курице 
LGG DyLight 350-конъюгированные, 122564, Agrisera; разведение 1:200) проводили при 
тех же самых условиях, указанных выше. После этого препараты были промыты в НСБ, и 
заключены в глицерин под покровное стекло (Chen et al., 2010). 
Полученные препараты были исследованы на флуоресцентном микроскопе 
(Axiolmager Z2 с ApoTome, MRM камеры; набором фильтров №49 – 365 возбуждения, 
эмиссия 445/50; № 65 HE – возбуждения 475/30, эмиссия 550/100; Carl Zeiss, Германия). 
Фотографии были получены в режиме многоканальной съемки в программе AxioVision 
4.8. Значения интенсивности флуоресценции DyLight 350 и FITS были определены в 
программе AxioVision 4.8 параллельно для каждого из каналов индивидуально для 
генеративной ткани, тапетума и средних слоев. Для расчета использовали не менее 50 
снимков для каждой стадии развития бутона.