Principe de la pcr

TARIXI

• 1983-yilda Kari Mullis tomonidan Polimeraza zanjir reaksiyasi (PCR) texnologiyasi ishlab chiqildi. DNK fragmentini suniiy siztez qilishning bu metodi PCR metodi deb nomlandi. Kari Mullis 1993-yilda bu metodi uchun kimyo bo’yicha Nobel mukofotiga sazovar bo’lgan.

• PCR texnologiyasini o’tkazishda amplifikator asbobi yordamida o’tkaziladi. Bu asbobda qizdirilgan probirkalar vaqti –vaqti bilan sovutilib turiladi.ular odatda 1°C xaroratli bo’lishi kerak.
• Bunda probirkalarga biror pereparatdan ajratib olingan DNK molikulasi va unga achitqilarning polimeraza fermenti solinadi va amflikator asbobiga joylanadi. Keyin polimeraza zanjir reaksiyasi boshlanadi.

PCR metodining asosiy prinsplari

• Fragment amplifikatsiyasi ikkta praymer o’rtasida ro’y beradi.
• Amplifikatsiya 30-40 siklda o’tadi.
• Xar bir sikl o’zining xarorat rejimiga ega.
• Xar bir reaksiya ni termostabil DNK polimerazalari amalga oshiradi.
• Xar 30 siklda amplikat DNK fragmenti bir milliard marta ko’payadi.

PCR reaksiyasining asosiy komponentlari.

• Bufer ( pH = 8,0-8,8; KCl)
• MgCl2 (1-3 mM)
• Praymer (0.4 mкm )
• ATF molikulasi
• DNK polimeraza (1 ед)
• Matritsa (1 до 1000 нг)

PCR texnologiyasi bu- qisqa vaqt ichida ma’lum DNK fragmentidan suniiy ravishda minglab nusxalarini olish imkonini beradi. Bunda dastlab olingan DNK molekulasi isitiladi spirali to’g’rilanadi va ikki komplementar zanjiri bir biridan ajratiladi. So’ngra praymerlar yordamida matritsa DNK zanjiridan komlementarlik asosida suniiy DNK ni ikkinchi zanjiri sintezlanadi.

• Bu samarali usuldan katta miqdordagi spetsifik
• Nukleotidlar ketma-ketligini nusxalarini olish mumkun.

Polimeraza zanjir reaksiyasining asosiy negizlari.

• Yuqori darajadagi sezgirlik
• Yuqori darajadagi spetsifiklik
• Sodda ish bajarish
• Ona DNK molekulasini tozalash zaruriyatini qiyinligini belgilash
• Xoxlagan biologik material bilan ishlash imkonini beradi.

PCR METODINING BOSQICHLARI

• Polimeraza zanjir reaksiyasi texnologiyasi 3-bosqichda boradi.
• Denaturatsiya
• Renaturatsiya yoki, praymerlarni xosil bo’lishi
• Sintez yoki Elongatsiya

Denaturatsiya.

• Denaturatsiya bosqichida DNK molekulasi 94—96°C tempraturada isitiladi. Bunda polimerazaning termostabilligi yo’qoladi. 05-2 minutdan so’ng DNK zanjiri to’g’rilanadi. Bu bosqichda DNK molekulasining qo’sh zanjirlari orasidagi vadorod bog’lari uziladi
• Ba’zan birinchi sikldan keyin reaksiya aralashmasi denaturatsiyasi 2-5minutda ketadi

1. Zanjirning ajralishi DENATURATSIYA

• 1. Zanjirning ajralishi DENATURATSIYA

• 95°C

Renaturatsiya (Отжиг)

• Agar tempratura kamaytirilsa praymerlar uchun birinchi zanjirli matritsa zanjirlar bilan bog’lanish yuzaga keladi. Bu xodisa kuydirish (отжигом.) yoki renaturatsiya deyiladi.
• Tempuraturali kuyish (отжига ) praymerlar tarkibidan qat’iy nazar odatda 4—5°С tanlanib yumshatiladi. Bu jarayonga 0,5-2 minut vaqt ketadi.

2. Renaturatsiya yoki praymerlarni xosil bo’lish bosqichi

• 2. Renaturatsiya yoki praymerlarni xosil bo’lish bosqichi

• Praymer
• Harorat ta’sirida kuydirish (отжига ) notog’ri bo’lsa praymerlarbilan matritsalar o’rtasidagi bog’lanish yomon yani spetsifik bo’lmagan maxsulotlar xosil bo’lishiga sabab bo’lishi mumkun.

Sintez yoki Elongatsiya

• DNK polimeraza praymerlar yordamida ona zanjirdan nusxa olishni boshlaydi. Bu bosqich elongatsiya yoki sintez bosqichi deyiladi.
• Polimeraza sintezi boshlanganda ikkinchi zanjirlar 3’ yakuniy praymerlardan uzoqlashadi. Bu jarayon praymerlar matritsa bilan bog’langanda va uzunasiga xarakat langanda sodir bo’ladi. 72 °C da polimerazalar aktiv xolatda bo’ladi

Polimeraza zanjir reaksiyaning (PCR) sxematik ko’rinishi.

• Denaturatsiya

• Praymerlar
• xosil bo’lishi

• 1 nusxa
• (матрица)

• 2 nusxa

• PCR maxsuloti

• Denaturatsiya
• Renaturatsiya
• Elongatsiya

• 1-bosqich reaksiyasidan xosil bo’lgan maxsulot

• 2-bosqich reaksiyasidan xosil bo’lgan maxsulot

PCR ketmasligining 10 ta sabablari.

• Yomon praymer dizayni.
• Noaniq praymer konstansiyasi.
• dNTP juda ko’p va degidratsiyaga uchrashi
• Не перемешанный раствор MgCl2
• MgCl2 ning noaniq konsentratsiyasi.
• Ingibitorning mavjudligi.
• Sifati yomon bo’lgan mineral yog’
• Juda ko’p fermentlar sintezi
• Amplifikator programmasidagi xatoliklar
• Keragidan ortiq matritsalar sintezi

E’TIBORINGIZ UCHUN RAXMAT