Практикум по молекулярной генетике учебно-методическое пособие

 
1.7 Выделение ДНК из растительных тканей 
При выделении ДНК из тканей растений важным фактором является 
эффективное разрушение клеточных стенок. Многие методы, используемые для 
этого, приводят к сильной фрагментации ДНК (из-за гидродинамических 
разрывов в цепи!). Часто приходится находить компромисс между размером 
ДНК и еѐ количественным выходом, ведь молекулы ДНК – самые крупные 
полимерные биомакромолекулы. Высвобождение высокомолекулярной ДНК из 
клеток – это только часть задачи, поскольку растительные экстракты содержат 
большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в 
ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК.
Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в 
присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующих 
агентов, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счѐт связывания 
двухвалентных катионов. От белков ДНП-комплекса избавляются фенольной 
депротеинизацией образца. Некоторые методики для освобождения ДНК от 
белков 
хроматина 
предусматривают 
использование 
протеиназ. 
После 
депротеинизации препарат всѐ ещѐ сильно загрязнѐн полисахаридами.
Распространены методы с использованием двух детергентов CTAB (
cetyl 
trimethyl aммonium bromid
) и SDS (
sodium dodecyl sulfate
). Метод с 
использованием СTAB (
Rogers, Bendich, 1985
) позволяет получать препараты 
растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и 
гибридизационного анализа. CTAB хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме 
того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они 
отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного 
вещества. При высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют 
стабильные, но вместе с тем растворимые комплексы со CTAB. При снижении 
концентрации соли ниже 0.4М NaCl происходит выпадение в осадок 
комплексов 
CTAB/нуклеиновая 
кислота, 
тогда 
как 
большая