Практикум по молекулярной генетике учебно-методическое пособие

1.3 Доочистка плазмидной ДНК (miniPrep) из бактериальных клеток 
методом фенол-хлороформной экстракции. 
 
ВСЕ ДЕЛАТЬ В ПЕРЧАТКАХ И ПОД ТЯГОЙ 
 
1. Плазмидную ДНК развести в 500 мкл деионизованной воды, внести 500 
мкл смеси фенола и хлороформа (1:1) и интенсивно потрясти, чтобы раствор 
стал как молоко. 
2. Центрифугировать 10 мин на максимальной скорости. 
3. Перенести верхнюю фазу 450 мкл (НЕ ТРОГАЯ БЕЛЫЙ 
ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ 
СЛОЙ) 
в 1 
мл изопропанола, перемешать 
и 
центрифугировать 10 мин на максимальной скорости. 
4. Осадок промыть 96% этанолом (500 мкл внести в эппендорф и затем 
вылить), высушить при 65
0
С в твердотельном термостате и ресуспендировать в 
20 мкл деионизованной воды или буфера ТЕ. 
1.4 Быстрое выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток 
для электрофоретического анализа (Real fast MiniPrep). 
 
Метод подходит для быстрой оценки наличия плазмиды, ее размера по 
сравнению с исходным вектором. Качество очистки ДНК достаточно для 
электрофоретического анализа, но не более того. Удобно использовать для 
скрининга колоний. Иногда в геле видны рибосомальные РНК, поэтому 
необходимы отрицательный и положительный контроли. 
 
1. Культуру растить ночь на богатой среде (LB, питательный бульон БТН 
или МПБ) с качанием, 3 мл в пробирке.

---

9 
2. Осадить клетки в эппендорф: 1.5 мл культуры перенести в эппендорф, 
центрифугировать 1-2 мин при 13000 об/мин. Удалить надосадочную жидкость, 
оставив 50-100 мкл.
3. Клетки ресуспендировать дозатором или на вортексе в 300 мкл раствора 
TENS. 
4. Инкубировать во льду 10 мин.
5. Добавить 150 мкл охлажденного раствора 3 М ацетата калия (29 г 
ацетата калия, 11 мл ледяной уксусной кислоты и 60 мл воды), размешать в 
вортексе. 
6. Смесь центрифугировать на холоду при 12 тыс. об/мин в течение 10 
мин для удаления преципитированной геномной ДНК. 
7. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) перенести в чистый 
эппендорф (лучше дозатором). Проследить чтобы не было белых хлопьев – 
остатков геномной ДНК. Добавить 900 мкл 96% этанола, охлажденного до -
20
0
С, перемешать и центрифугировать в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин.
8. Супернатант вылить. Осадок промыть 96% этанолом (500 мкл внести в 
эппендорф и затем вылить), высушить при 65
0
С в твердотельном термостате и 
ресуспендировать в 20 мкл деионизованной воды или буфера ТЕ.