Практикум по молекулярной генетике учебно-методическое пособие

 
1.8 Выделение ДНК из крови с помощью смолы Chelex 
 
Основная 
процедура 
выделения 
включает 
в 
себя 
очистку 
от 
металлосодержащих соединений и протеинов с последующим кипячением 
образца в присутствии Chelex 100, затем супернатант непосредственно 
добавляют в ПЦР смесь. 
1. В центрифужную пробирку на 2 мл вносят 1 мл стерильной 
дистиллированной воды и добавляют 5 мкл крови или 3 мм
2 
материала с 
засохшей кровью. Тщательно перемешивают.
2. Инкубируют при тщательном перемешивании 20 мин при комнатной 
температуре (лучше всего использовать ротатор для центрифужных пробирок).
3. Центрифугируют при 10 000 g 3 мин и удаляют супернатант, оставляя 
(чтобы не взмутить осадок клеток или ткань) 20-30 мкл.
4. Добавляют 5% раствор Chelex-100 до конечного объема 200 мкл (Chelex 
в натриевой форме, 5% раствор в стерильной дистиллированной воде). Перед 
добавлением смолу перемешивают до гомогенного состояния пипеткой с 
широким отверстием.
5. Инкубируют при 56 ºС 30 мин и встряхивают в течение 10 сек.
6. Кипятят образец 8 мин при 95 ºС, встряхивают в течение 10 сек. и 
центрифугируют при 10 000 g 3 мин.
7. Для ПЦР берут из полученного супернатанта 20 мкл. 
 
 

---

14 
Растворы: 
1.
Среда LB 
2.
Буфер TE. 10мМ Тris–HCl, pH 8.0; 1мМ ЭДТА. 
3.
Насыщенный буфером фенол. В большинстве случаев фенол высокой 
степени чистоты можно использовать без дополнительной перегонки. 
Расплавляют фенол при 65 °С в присутствии равного объема 0.1 М 
трис-HCl, рН 7.8-8.0, содержащего 0.2% 2- меркаптоэтанола (2-МЭ) 
(ядовит, летуч!, работать под тягой!). Когда фенол полностью 
расплавится, тщательно перемешивают смесь, отбирают насыщенный 
фенол (жидкий, нижняя фаза). В таком виде фенол может хранится при 
4 °С до 1 мес, замороженный при -20 °С - в течение нескольких 
месяцев. 
4.
Смесь 
фенол–хлороформ-изоамиловый 
спирт. 
Водонасыщенный 
фенол, хлороформ и изоамиловый спирт смешивают в пропорции 
25:24:1 по объему. 
5.
10% SDS
6.
2M NaCl 
7.
10 mM Трис HCl рН 8.0
8.
Раствор I: 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl, pH 8.0, 
РНКаза А 
9.
Раствор II: 0.2М NaOH и 1% SDS, смешать 1 мл 2М NaOH, 1 мл 10% 
SDS и 8 мл деионизованной воды 
10.
Раствор III: 3 М ацетат калия, 5М уксусная кислота (29 г ацетата калия, 
11 мл ледяной уксусной кислоты и 60 мл воды 
11.
Раствор лизоцима в 10мМ Тris–HCl, 20 мг/мл, хранить при -18 ºС. 
12.
TENS: 10 мМ Трис-HCL, pH 8.0, 1 мМ EDTA, 0.1 Н NaOH, 0.5% SDS; 
для приготовления 100 мл взять 1 мл 1 M Трис-HCL, pH 8.0, 200 мкл 
0.5 M ЭДТА, pH 8.0, 5 мл 2 М NaOH, 5 мл 10% SDS, довести водой до 
100 мл. 
13.
10-кратный буфер для «внесения» в лунку геля: 1 мл 2х-кратный ТВЕ 
или ТАЕ буфер, 200 мкл 10% SDS, 600 мкл глицерина, 200 мкл воды, 
крупинка бромфенолового синего 
14.
Буфер SSC. 3M NaCl; 0.3M цитрат натрия, pH 7,0. Для приготовления 
концентрированного 20 SSC на 1 л нужно взять: NaCl – 175.3 г; цитрат 
натрия – 88.2 г. pH раствора доводить обычно не требуется
15.
0.2M ацетат натрия, pH 5.2. Готовится разведением 3М раствора
16.
Буфер для экстракции. 100мM Tris–HCl, pH 8,0; 50мM ЭДТА; 500мM 
NaCl; 1.25% SDS; 8.3мM NaOH; 0.83% Na
2
S
2
O
3

---

15