10-seminar Genom DNK ajratish uchun eritmalar va asboblarni tayyorlash
Ishning maqsadi: E.coli bakteriyasi hujayralaridan plazmid DNK sini va odam
qonidan genom DNK sini hamda DNK namunalarini ajratish printsiplari va
usullari bilan tanishish.
Ishning vazifasi:E.coli bakteriyasi hujayralaridan plazmid DNK sini va odam
qonidan genom DNK sini ajratib olish koʼnikmalarini shakllantirish.
Nazariy qism.
Plazmidalar - hujayraning avtonom ravishda replikatsiya boʼladigan
genetik
elementlari boʼlib, xalqasimon tuzilishiga ega DNK molekulasidan iborat.
Plazmid DNK sini ajratib olish usuli bakteriya plazmidalarining tuzilishi
jihatidan genom DNK siga nisbatan kichik oʼlchamda boʼlishi va yopiq
halqasimon koʼrinishga ega boʼlganligiga asoslanadi. Bunda dastlabki bosqich
bakteriya hujayralariga EDTА va lizotsim (grammanfiy bakteriyalarda)
bilan
ishlov berib ularni sferoplastlarini hosil qilinadi. EDTА metall ionlari bilan xelat
hosil qilib, DNK ni kationga bogʼliq nukleazalar taʼsiridan himoya qiladi.
Olinadigan sferoplastlarning tezda lizis boʼlib ketishini oldini olish maqsadida
reaktsiyani izotonik eritmalar (saxaroza yoki boshqa moddaning ancha yuqori
kontsentratsiyasi) da olib boriladi. Soʼngra sferoplastlarni lizis qilinadi. Buning
uchun, detergentlar qoʼshishni tavsiya qilingan. Hujayra qobigʼi bilan bogʼlangan
qoldiqlar va bakteriya xromosomasining boʼlaklarini sentrifugalash yoki
filьtrlash yoʼli bilan olib tashlash mumkin.
Plazmid DNK sini ajratish usullari orasida bakteriyalar
hujayralarini ishqor
yordamida lizis qilish usuli ( Birnboym – Doli usuli ) va uning modifikatsiyalari
koʼproq ishlatiladi. Bu usuldan mini-preparatlar olishda ham DNK ni yirik
hajmda ajratib olishda ham keng qoʼllaniladi. Ushbu usul ishqoriy muhitda (~rN
12,0–12,5) DNK molekulalarining chiziqli strukturasining denaturatsiyasi (qoʼsh
xalqaning yozilishi), ayni vaqtda yopiq xalqali molekulalarni esa denaturatsiyaga
uchramasligi yoki oz miqdorda va qaytar darajada denaturatsiyaga uchrashiga
asoslangan.
Hujayra ekstraktini tuzlarning yuqori kontsentratsiyasida neytrallanganda,
oqsillar, genom DNK si va hujayra RNK si choʼkmaga tushadi. Bunga tuzlarning
yuqori kontsentratsiyasida bir zanjirli
DNK va RNK molekulalarining
denaturatsiyasidan keyin tasodifiy va tartibsiz ravishda reassotsiatsiyalanishi
sabab boʼladi. Reaktsiyani natriy dodetsilsulьfat Na (SDS) ishtirokida olib
borilganligi uchun hujayra RNK sining katta qismi oqsillar bilan birga choʼkmaga
tushadi. Preparatdagi (ichki molekulyar qoʼsh zanjirli uchastkalari oson hosil
boʼlganligi sababli, asosan, transport RNK si nisbatan oson renaturatsiyalanadi
va tuzning yuqori kontsentratsiyasida erib ketadi)
hujayra RNK si ning qolgan
qismini RNKaza А bilan yoʼqotiladi.
Sentrifugalash yoʼli bilan choʼkmadan holi qilingan plazmid DNK sini
tiniqlashgan hujayra lizatidan etanol yoki izopropanol yordamida choʼktiriladi.
Bunday DNK preparatidan bir qancha maqsadlarda, masalan, restriktsion tahlillar
uchun foydalanish mumkin. Koʼplab alohida tadqiqotlar uchun DNK ning bir
muncha toza preparativ shakllari zarur boʼladi, masalan, klonlash chun
fragmentlar tayyorlashda yoki transfektsiyani amalga
oshirishda DNK keyingi
tozalash boqichlari oʼtkaziladi.
Deyarli barcha molekulyar biologik tadqiqotlar uchun muvofiq keladigan kichik
oʼlchamdagi DNK ning yuqori darajadagi toza preparatlarni olish uchun DNK ni
shishadan tayyorlangan filьtrli kolonkalarda (glass), kvarts usulida tozalash
(silicaslurries) yoki silikagelь (silica-gelmembrane) bilan tozalash usullari keng
qoʼllaniladi. Bunda DNK xaotrop tuzining yuqori kontsentratsiyali eritmasida
qaytar ravishda shisha membrana yuzasiga sorbtsiyalanadi va qolgan
aralashmalarni xaotrop tuzi va 70% li etanol bilan yuviladi. Soʼngra tozalangan
DNK kichik ionli kuchlanishga ega buferda ajratib olinadi (elyuirlanadi). Kam
miqdordagi plazmid DNK sini yoki uning fragmentlarini xuddi shunday silikat
filьtrli sentrifuga mini-kolonkalarida tozalash usuli ham koʼp qoʼllaniladi.
Bunday toʼplamlarni koʼplab firmalar tomonidan ishlab chiqariladi.
Odam genom DNK sini ajratib olishda yadroga
ega istalgan hujayradan
foydalanish mumkin. Odam materiali sifatida koʼpincha leykotsitlar, bukkal
hujayralar (yonoq epiteliysi hujayralari) qoʼllaniladi. Qanday hujayra
ishlatilishiga koʼra, toza mahsulotning maksimal
miqdorini olishga imkon
yaratadigan DNK ajratishning optimal usullarini tanlash kerak boʼladi.
Genom DNK sini ajratib olish uchun plazmatik va yadro membranalarini yorib,
hujayra oqsillaridan holi qilinadi. Nuklein kislotalardan oqsillarni olib tashlash
uchun ularni fenolom va (yoki) xloroform bilan eksraktsiya qilinadi. Hujayra
lizatlaridan DNK ajratishda oqsillarni yoʼqotish uchun koʼpincha oqsillarning
keng spektriga nisbatan faol boʼlgan proteolitik fermentlar, masalan, proteinaza
K bilan gidroliz qilinadi.
