“биология”

3-расм.
TALEN химерик оқсилларини экспрессияловчи генетик конструкцияларни яратиш учун Golden Gate 
клонлаш тизими асосида модулли иерархик лигирлаш стратегиясининг схемаси. А- биринчи босқичда 
деталлар тўпламидан иборат ўзига хос “конструктор”ни тақдим этувчи мономерлар кутубхонаси яратилади. 
Ушбу деталлар- специфик олигонуклеотид праймерлар ёрдамида амплификация қилинган мономерларнинг 
кетма-кетликларидир. праймерлар шу тарзда тузиладики, IIS типли эндонуклеаза рестрикцияларининг 
гидролизи натижасида ёпишқоқ учлар ҳосил бўлиши зарур, бу ёпишқоқ учлар тайёр конструкцияда мономер 
позициясини (жойлашувини) аниқлаб беради. Б- бир Golden Gate реакциясида бир вақтнинг ўзида бир неча 
мономерларни лигирлаш имконияти бор, буларнинг натижасида оралиқ к-ўлчовли конструкциялар олинади. 
В- сўнгги босқичда Golden Gate реакцияси ўтказилади, бунинг натижасида бир неча оралиқ к-ўлчовли 
конструкцияларнинг ва TALEN нинг қолган элементларини ўзида тутган “асос” плазмидаларнинг рестрикция 
ва лигирлаш ҳодисаси содир бўлади.

---

47 
Invitro шароитларда ва бактерия хужайраларида CRISPR/ Cas9
 
ёрдамида
 
ДНКни қирқиш учун қуйидаги компонентлар талаб этилади ва етарли 
ҳисобланади: кодирламайдиган РНК tracrRNA ва pre-crRNA, РНКаза III ва 
Cas9 оқсили. Ушбу тизимни сут эмизувчилар хужайраларида қўллаш бир 
қатор афзалликларни беради. 
Биринчидан, SpCase9 (Cas9 
S. pyogenes
) нуклеазаси кодонлар томонидан 
оптималлаштирилган юқори эукариотлар хужайрасидаги транскрипция 
жараёнига мослашиши зарур ҳамда ядро компартментализациясини 
таъминлаш учун ядро локализацияси сигналларини бирлаштириш лозим 
(NLS- nuclear localization signal). Икки NLS Cas9 ни ядрога самарали 
(эффектив) йўналтириш учун етарлидир. 
Иккинчидан, эукариот хужайраларда pre-crRNA ларни тайёр бўлиши учун 
экзоген РНКаза III киритилиши талаб этилмайди, чунки бу вазифани ўз 
хужайра РНКазалари самарали амалга оширади. 
Учинчидан, кодирламайдиган икки РНК ўрнига кўпинча ягона химерик 
sgRNA киритилади, бунда синтетик структура “бигиз-асос” ёрдамида табиий 
crRNA-tracrRNA дуплексларни ўрнини босиш мақсадида етук crRNA 
tracrRNA қисми билан бирлашган бўлади (4-расм). sgRNA транскрипцияси 
учун мос келувчи промотор талаб этилади, масалан РНК-полимераза III 
алоқадор U6- промотори.