89
§ 14. Гель электрофорези. ДНК гибридизацияси
Агарозали гелда ДНК электрофорези – ДНК фрагментларини
узунлиги бўйича бўлиш учун қўлланиладиган аналитик усул. Турли
хил ўлчамга эга фрагментларнинг ташқи электр майдони таъсири
остида гелда ҳаракатланишидаги турлича ҳаракат
тезлигига
асосланган.
Усулнинг қўлланилишидан бири – плазмид ДНКни тадқиқ
қилиш. У одатда халқасимон ва иккиламчи тузилмаларни ҳосил
қилади, масалан, суперспиралга буралади. Шундай қилиб, плазмида
ўлчамини аниқлаш учун иккиламчи тузилмалар элементларини
бузиш зарур. Бунинг учун гелга суртишдан олдин плазмида
“линеарланади” (чизиқли қилинади), яъни рестриктазалардан
(эндонуклеазалардан) бири билан ишлов берилади. Рестриктаза
шундай танланадики, у плазмидани фақат бир жойидан кесиш керак.
Турли хил ўлчамли ДНК фрагментларини бўлиш учун турлича
концентрацияга эга агарозали гелдан фойдаланилади. Бўлинаётган
ДНК фрагментларининг узунлиги қанчалик кам бўлса, агароза
концентрацияси шунчалик катта бўлиши керак:
Бўлинаётган ДНК фрагментининг
узунлиги
Агароза
концентрацияси,
%
50-1500 н.ж.
2
300-3000 н.ж.
1,5
400-6000 н.ж.
1,2
500-10000 н.ж.
1
800-10000 н.ж.
0,7
1000-20000 н.ж.
0,5
90
Электрофорез ўтказилганда ДНК
фрагментлари гелда электр
майдони кучи остида миграцияланади. Гап шундаки, ДНК
молекулаларининг шакарфосфатли рамкаси манфий зарядланган ва
шу сабабдан ДНК занжирлари манфий зарядланган катоддан мусбат
анодга қараб ҳаракатланади. Анча узунроқ молекулалар секинроқ
миграцияланади, чунки гелда секин ҳаракатланади, анча қисқароқ
молекулалар тезроқ ҳаракатланади.
ДНК электрофорезидан кейин агароз гель фотосурати. Чап йўлакча – маълум
ўлчамли ДНК фрагменти
ПЗР маҳсулотларининг электрофорез усули билан бўлиниши натижалари.
Агароз гель ультрабинафша нурлари таъсири остида флуоресценцияланадиган
бромид этидий билан бўялган (бу ерда 312 нм тўлқин узунлиги билан)
Электрофорез бошланишидан олдин электрофорез боришини
визуаллаштириш ва намуналарни глицерин билан оғирроқ қилиш
учун (намунада глицерин 20%гача)
намуналарга pHи кислотали
кўрсаткичга эга икки хил бўёқ (бу мақсадда кўпинча ксилен ҳаво
ранги ва бромфенол кўкидан фойдаланилади) қўшиш одатий холдир.
Бўёқ шунингдек жараённи қачон тўхтатиш лозимлигини аниқлаш
учун ҳам зарур.
Электрофорез буферли эритма билан тўлдирилган камерада
ўтказилади. Кўпинча таркибида ЭДТА, трис, борат ва сирка
кислотаси бўлган буфердан фойдаланилади. Шунга мувофиқ
борат
кислотали буфер TBE (tris-borate-EDTA), сирка кислотали буфер эса
-TAE (tris-acetate-EDTA) деб номланади. TBE ва TAE она эритмалари
91
концентрациялари агар уларни ишчи концентрациялар билан
солиштирилса мос равишда 6x ва 50x ни ташкил қилади. Буфер
қўйилган электр майдони таъсири остида ДНК молекуласининг
бўлиниши содир бўладиган эритманинг
ион кучини ошириш учун
зарур.
Бўлинишдан кейин (баъзан бўёқ эритилган агарозага солинади)
турли хил узунликка эга ДНК фрагментлари ДНК билан специфик
ўзаро
таъсирга
эга
флуоресцент
бўёқлар
ёрдамида
визуаллаштирилади, масалан, агароз геллар одатда дуплекс азот
асослари
ўртасида
интеркалирлайдиган
ва
УБ-нурларида
флуоресценцияланадиган бромид этидий билан бўялади. Ўлчамларни
аниқлаш узунлиги маълум ДНК («DNA ladder», «линейка», «ДНК
маркерлари») тижорий фрагментлари тўпламлари ва текширилаётган
намуналардаги ДНКни солиштириш йўли билан амалга оширилади.
Одатда чизиқлар интенсивлигини солиштириб текширилаётган
намуналарда ДНК концентрациясини тезликда баҳолаш мумкин
бўлиши учун тижорий маркерларда алоҳида
фрагментлар таркиби
ҳам кўрсатилади. Лозим бўлса плазмидага уни бир нечта жойидан
кесадиган рестриктаза билан ишлов бериб, гель учун ДНК
маркерларини мустақил тайёрлаш мумкин. Бунинг учун эндонуклеаза
танлаб олинади, унинг таъсири остида турли хил узунликдаги 5-6 та
фрагмент ҳосил бўлади.
Одатда ДНКнинг электрофоретик таҳлили
учун агароза
гелидан фойдаланилади, лекин агар ДНКнинг бўлинадиган
фрагментлари бир неча ўн жуфт нуклеотид узунлигига эга бўлса, у
ҳолда полиакриламид гелдан фойдаланиш мумкин. Полиакриламид
гелдан
шунингдек,
ДНКни
секвенирлашда
ДНК
қисқа
молекулаларини юқори аниқликлаш учун фойдаланилади.
Do'stlaringiz bilan baham: 
