|
Oqsillarni ajratish usullari.
1. Selektiv denaturatsiya.Eritma 50-70 °C ga qizdirilganda yoki pH ≈ 5 gacha kislotalanganda ko'plab oqsillar denaturatsiyalanadi va cho'kma hosil qiladi. Agar chiqarilgan oqsil ushbu shartlarga chidamli bo'lsa, unda begona oqsillarning bir qismi eritmadan shu tarzda olib tashlanishi mumkin.
2. Tuzlash - turli tuzlarni qo'shganda eritmadan oqsillarni cho'ktirish jarayoni. Oqsillarning eruvchanligi ammoniy sulfat kontsentratsiyasiga bog'liqligi ko'pincha qo'llaniladi. Agar eritma oz miqdorda (NH4)2SO4 (masalan, 10ml eritmasiga 100g) qo'shilsa, unda eng kam eriydigan oqsillar cho'kadi. Cho'kma sentrifuga bilan ajratiladi va qo'shimcha 10 g (NH4)2S04 cho'kindi suyuqligi qo'shiladi va ikkinchi cho'kma olinadi. Ushbu amaliyotni davom ettirib, bir qator fraktsiyalar olinadi:ulardan birida kerakli protein miqdori boshqalardan ko'ra ko'proq.
3. Ion almashinuvi xromatografiyasi va elektroforez usullari amino kislotalar radikallarining ionogen guruhlari miqdori va tabiatidagi farqlarga asoslanadi. Oqsillarning xromatografiyasi uchun sellyuloza yoki boshqa hidrofill polimerlarga asoslangan ion almashinuvi qo'llaniladi.
Elektroforez turli xil variantlarda qo'llaniladi. Ularning eng oddiylari qog'ozda - elektroforezdir. Filtr qog'ozining chizig'i bufer eritmasi bilan singdirilgan va to'g'ridan-to'g'ri oqim bilan elektr zanjiriga ulangan. Jarayon germetik yopiq xonada amalga oshiriladi. Elektroforegramdan olingan oqsillar ipni oqsillar bilan bog'laydigan va rangli birikmalar hosil qiluvchi bo'yoq bilan davolash orqali aniqlanadi. Protein molekulasining zaryadiga qarab, oqsillarni fraktsiyalarga yakuniy ajratishdan so'ng, individual oqsillar (ipni oldindan kesib tashlash) mos hal qiluvchi va cho'kma bilan yuviladi. Ko'p miqdorda tozalangan oqsilni olish uchun qog'oz chizig'i o'rniga, bu usulda ba'zi inert materiallardan iborat qalin blok - kraxmal, tsellyuloza kukuni yoki gel hosil qiluvchi polimerlar - agar, poliakrilamid ishlatiladi.
4. Gel filtrlash va ultrasentrifugatsiya usullari molekulyar og'irlikdagi oqsillarning farqlariga asoslangan.
Proteinlarning molekulyar massasi o'nlab va yuz minglab atom massa birligi (a.m.b, yoki Da) ga yetadi. Molekulyar massani aniqlashning an'anaviy usullari-kriyoskopiya va ebulioskopiya - oqsillar uchun qo'llanilmaydi. Oqsillarning molekulyar massasini aniqlash uchun maxsus usullar ishlab chiqildi. Ularning eng keng tarqalgan usuli - Shvetsiya olimi Svedberg tomonidan ishlab chiqilgan ultrasentrifugalash usuli. Bu moddalarning sedimentatsiya tezligini o'lchashga asoslangan. Aylanadigan rotorda Ultra-markazlashtiruvchi markazdan tezlashtirish 100000-500000 g (g - tortishish tezligi) ga yetadi. Ultratsentrifuganing kyuvetasiga quyilgan bufer eritma yuzasiga oqsil eritmasidan yupqa qatlam surtiladi va kyuvetka rotorga joylashtiriladi. Rotor aylanganda, erituvchidan zichroq bo'lgan oqsil molekulalari aylanish o'qidan uzoqroq yo'nalishda harakat qiladi. Protein zonasining pozitsiyasi tampon eritmasiga qaraganda oqsil zonasida katta bo'lgan sinishi indeksi bo'yicha maxsus optik tizim tomonidan qayd etiladi. Sentrifuga natijalari asosida, sedimentasyon koeffisiyenti hisoblanadi
x-aylanish o'qidan oqsil zonasiga masofa, sm;
t-sedimentatsiya vaqti, s;
dx / dt-sedimentatsiya darajasi, sm/ s;
w-rotorning aylanish tezligi, rad / s.
Sedimentatsiya koeffitsientining birligi uchun Svedberg deb ataladigan va "S"deb nomlangan 10-13 s qiymati shartli ravishda qabul qilinadi.
Proteinning molekulyar massasi uning sedimentatsiya koeffitsienti, diffuziya va zichlik koeffitsienti bilan proportsionaldir:
R-universal gaz (8.314 Dj / grad.mo'l);
T-mutlaq tajriba harorati;
S-sedimentatsiya koeffitsienti, s;
O-diffuziya koeffitsienti, sm2 / s;
V-protein molekulasining o'ziga xos parentsial hajmi, ya'ni molekula zichligining teskari qiymati, sm3 / g;
p-ma'lum bir haroratda hal qiluvchi zichligi, g / sm3.
Proteinning molekulyar massasi gel filtrlash yoki molekulyar saralash orqali aniqlanishi mumkin. Usul maxsus polimer moddalardan (masalan, sefadeks) foydalanishga asoslangan bo'lib, shishgan donalari ma'lum o'lchamdagi ko'zalarni egallaydi. Kichik molekulalar bu bo'shliqlarga osongina kirib boradi va katta molekulalarning tarqalishi qiyin. Ushbu hodisa gel filtrlash usuli bilan moddalarni ajratishning asosidir. Usulning sxematik diagrammasi quyidagi rasmda ko'rsatilgan, oqsil eritmasi bufer bilan birgalikda sefadeks granulalari orasidagi ustun bo'ylab harakatlanadi. Proteinlar bufer eritmasiga qaraganda sekinroq o'tadi va sekinroq oqsilning molekulyar og'irligi shunchalik kichik bo'ladi, chunki ularning molekulalari Sedafeks granulalariga osonroq tarqaladi.
Natijada, ustunda oqsillarning alohida zonalari hosil bo'ladi: zona qanchalik past bo'lsa, oqsilning molekulyar og'irligi shunchalik katta bo'ladi. Yuvish hajmi (kolonnadan berilgan fraksiyani yuvish uchun ishlatiladigan bufer eritmaning hajmi - V, ml) va molekulyar og'irlik logarifmi (IgM) o'rtasida chiziqli bog'liqlik mavjud. Kolonnadan molekulyar og'irligi ma'lum bo'lgan standart oqsillarning eritmalarini o'tkazish yo'li bilan oldindan kalibrlanadi.
Do'stlaringiz bilan baham: |
