O‘zbekiston respublikasi oliy va o‘rta maxsus ta’lim vazirligi urganch davlat universiteti “Biologiya” kafedrasi

Ikki tomonlama diffuziya usuliOakley va Fultorts (S. L. Oakley, AJ Fulthorpe, 1953) bo'yicha probirkalarda yoki kapillyarlarda: antikorlarni o'z ichiga olgan jel va antijenlarning eritmasi sof jel ustuni bilan ajratiladi. Antigenlar va antitellarning qarshi diffuziyasi natijasida oraliq geldagi ularning optimal nisbati zonalari siljimaydi va hosil bo'lgan yog'ingarchilik chiziqlari reaktsiya vaqtida ko'chib ketmaydi. Jel ustunlaridagi I. usullari, odatda, qiyin antigen tizimlardagi antigenlar to'plamini tahlil qilish va antigenlarning diffuziya konstantalarini aniqlash uchun qo'llaniladi. Biroq, ular turli tizimlardagi antijenlarni solishtirish uchun kam qo'llaniladi. Immunokimyoda sezilarli darajada kengroq qo'llanilishi Ouchterlony (0. Ouchterlony, 1948, 1953) bo'yicha geldagi qo'sh diffuziya usuli bilan olingan. Immunodiffuzionning ushbu variantida murakkab tizimlarda turli antijenlarni aniqlash printsipi ularni bir nechta tizimlarda bevosita identifikatsiya qilish imkoniyati bilan birlashtirilgan. Reaksiya agar-gel plastinkalarida shisha ustida yoki Petri idishlarida olib boriladi. Qattiqlashtirilgan jelda bir-biridan ma'lum masofada teshiklar kesiladi va antijenler va antiserumlar eritmalari bilan to'ldiriladi. Antigenlar va antikorlarning optimal nisbati bilan quduqlar orasidagi jelda cho'kma chiziqlar hosil bo'ladi. Reagentlar quduqlardan konsentrik ravishda diffuziya qilinganligi sababli, usul antiserum qudug'i atrofida turli antigen preparatlari bo'lgan bir nechta quduqlarni joylashtirish orqali bir vaqtning o'zida bir nechta reaktsiyalarni amalga oshirishga imkon beradi. Periferik quduqlarni antiserumlar bilan, markaziy quduqlarni antigenik eritma bilan to'ldirib, turli xil kelib chiqadigan sarumlardagi antitellar to'plamini tekshirish mumkin. Yog'ingarchilik zonalarining ulanish tabiati, bir xil antiserum bilan reaksiyada solishtirilgan tizimlarning antigenlari tomonidan hosil bo'lgan noaniq bo'lib, antigenlarning o'xshashligi yoki farqi darajasi bilan belgilanadi. Qo'shni reaksiyalar chegarasida yog'ingarchilik zonalarining silliq to'liq qo'shilishi yoki qisman qo'shilishi antijenlarning to'liq o'xshashligini yoki qisman o'xshashligini ko'rsatadi, yog'ingarchilik zonalari uchlarining kesishishi (ya'ni, "shpur" shakllanishi) antijenlarni o'rgangan. Ouchterlon bo'yicha reaksiyani qo'sh diffuziya usuli bilan shakllantirish texnik jihatdan qiyin emas. 1-1,5% li agar jeli tayyorlanadi, agar erigan holatda Petri idishlariga yoki 1,5-3 mm qatlamli shisha plastinkalarga quyiladi. Muzlatilgan jelda teshiklar kesiladi, ularning soni, shakli, o'lchami va joylashishi tajribaning aniq maqsadlariga bog'liq. Teshiklarning chiziqli joylashishi bir necha qatorda qo'llaniladi, GI Abelev (1960) tomonidan ikkita to'liq antigen-antikor tizimini tahlil qilish uchun taklif qilingan "kvadrat" sxema bo'yicha teng tomonli uchburchakning burchaklarida markazda antiserum uchun quduq bo'lgan doira bo'ylab yoki eksantrik va boshqa joylashgan. variantlar. Quduqlarni reaktivlar bilan to'ldirgandan so'ng, plitalar nam kameraga joylashtiriladi. Reaksiya xona haroratida bir necha soat yoki kun davomida rivojlanadi. Natijalarni qayd qilish uchun plitalar suratga olinadi; yuvilgan va quritilgan plitalardagi cho'kma chiziqlari oqsil uchun bo'yoqlar bilan bo'yalgan, ba'zi hollarda antijenlarning fermentativ faolligini aniqlash uchun gistokimyoviy reaktsiyalarni o'tkazish mumkin. Polivalent antiserumlar bilan ishlash immunodiffuzion tahlilning birinchi bosqichlaridan biridir. Ko'pincha antijenlarning butun spektrini o'rganish kerak emas, polivalent antiserum tomonidan aniqlangan, ammo tadqiqotchini qiziqtirgan ma'lum antijenler. "Keraksiz" reaktsiyalarni blokirovka qilish uchun jel oldindan heterologik tizimning tegishli antijenleri bilan to'yingan.
I. usullaridan foydalangan holda preparatlar tarkibidagi antigenlarning miqdoriy bahosini monospesifik antiserumlar mavjudligida olish mumkin. Tahlil antijenik preparatlarni titrlash va standart namuna yoki sinov tizimi bilan solishtirganda ijobiy reaktsiya beradigan yakuniy suyultirishni aniqlash orqali amalga oshiriladi. Antijenlarning tarkibini aniqlashning miqdoriy usuli, shuningdek, Manchini radial immunodiffuziya usuliga ko'ra reaktsiyalarni shakllantirishdir (G. Mancini, 1965). Bunda antijenlarni o'rganilayotgan antigenga antikorlarni o'z ichiga olgan jelga diffuziya qilish printsipi qo'llaniladi. Halqasimon yog'ingarchilik zonalarining radiuslarini aniqlash, ularning ma'lum bir antigen kontsentratsiyasiga bog'liqligining oldindan tuzilgan egri chizig'iga ko'ra, preparatdagi antigenning tarkibi hisoblanadi. Immunodiffuzion tahlilda radioyorliqli antigenlar va antitellardan foydalanish antijenlarni o'rganishda printsipial jihatdan yangi imkoniyatlar ochadigan immunoautoradiografiya usullarini ishlab chiqishga olib keldi. Immunoautoradiografiya usullaridan biri antigenlarning biosintezini o'rganish uchun mo'ljallangan [Perelmann va Haltin (P. Perelmann, T. Xultin), 1958; G. I. Abelev, R. D. Bakirov, 1968]. Usul quyidagi bosqichlardan iborat: a) in vivo yoki in vitro sharoitda to'qimalarga izotopik etiketli antigen prekursorlarini (masalan, oqsillar uchun 140C-aminokislotalar) kiritish; b) oʻrganilayotgan antigenlarga toʻqima ekstrakti va oʻziga xos antiserumlar bilan I. reaksiyalarini oʻtkazish; v) reaksiyalarning avtoradiografiyasi I. Muallifning adiografik nashrlarini olish uchun reaksiyaga kirmagan moddalardan yuvilgan va quritilgan agar jel plitalari fotografik emulsiya bilan qoplanadi yoki yuqori sezgir fotografik plyonka qo'llaniladi. EHM vaqti empirik tarzda o'rnatiladi. Muntazam ro'yxatga olish paytida immunodiffuzion tahlil natijalarini taqqoslash vaavtoradiografiya(qarang) o'rganilayotgan to'qimalarda antijenlarning mavjudligi va sintezini hukm qilish imkonini beradi. Usul antigenlarning sekretsiyasini tahlil qilish uchun ham keng qo'llaniladi. Shu maqsadda to‘qima bo‘laklari yoki dissotsilangan hujayralar radioaktiv yorliqli prekursorlarni o‘z ichiga olgan kichik hajmdagi muhitda inkubatsiya qilinadi va konsentrlangan madaniyat muhiti immunoautoradiografiyada tekshiriladi. Yog'ingarchilik zonalarini vizual ro'yxatga olish uchun immunodiffuzion usullarning sezgirligi 1-4 mkg / ml ni tashkil qiladi. Immunodiffuzionning sezgirligini oshirish uchun Rowe (DS Rowe, 1969) bilvosita immunoautoradiografiya usulini ishlab chiqdi. Usul printsipi bilvosita immunofloressensiyada qo'llaniladigan "sendvich" printsipiga o'xshaydi (2-rasmga qarang).Immunofluoresans), va cho'kma tarkibidagi antikorlarga radioaktiv yorliqli immunoglobulinlar yordamida agar jelida ko'rinmas cho'kmani aniqlashdan iborat. Buning uchun reaksiyaga ega yuvilgan agar plitalari o'rganilayotgan antigenga immun zardobi olingan hayvonlarning ushbu turining antikorlariga etiketli yoki immunoglobulinlar eritmasi bilan ishlov beriladi. Shu tarzda qayta ishlangan reaksiyalarning avtoradiografiyasi And. 0,1 — 0,05 m kg/ml kontsentratsiyadagi individual antigenlarni topish imkonini beradi.
Bilvosita immunoautoradiografiya usuli Ouchterlon (D. A. Elgort, G. I. Abelev, 1971) bo'yicha radial (Row, 1969) va ikki tomonlama diffuziya uchun ham ishlab chiqilgan. Yuqori sezuvchanlikka qo'shimcha ravishda, usul shubhasiz afzalliklarga ega, chunki u immun zardobidagi antikorlarning cho'kma hosil bo'lishida ishtirokini osonlik bilan nazorat qilish va hokazo. tadqiqot natijalarini buzishi mumkin bo'lgan turli artefaktlarni istisno qilish. Immunodiffuziya usullari yaxshi takrorlanadigan natijalarni olish va murakkab tizimlarda antijenlarni aniqlash imkonini beradi. Biroq, I. usullaridan foydalanish cheklangan, chunki ular faqat eruvchan antijenler va antitellarni tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkin, ularning o'zaro ta'siri cho'kma hosil bo'ladi.