Oliy va o’rta maxsus ta’lim vazirligi Termiz Davlat Universiteti

3-rasm. TALEN ximerik oqsillarini ekspressiyalovchi genetik konstruksiyalarni yaratish uchun Golden Gate klonlash tizimi asosida modulli iyerarxik ligirlash strategiyasining sxemasi. A- birinchi bosqichda detallar to’plamidan iborat o’ziga xos “konstruktor”ni taqdim etuvchi monomerlar kutubxonasi yaratiladi. Ushbu detallar- spetsifik oligonukleotid praymerlar yordamida amplifikatsiya qilingan monomerlarning ketma-ketliklaridir. praymerlar shu tarzda tuziladiki, IIS tipli endonukleaza restriksiyalarining gidrolizi natijasida yopishqoq uchlar hosil bo’lishi zarur, bu yopishqoq uchlar tayyor konstruksiyada monomer pozitsiyasini (joylashuvini) aniqlab beradi. B- bir Golden Gate reaksiyasida bir vaqtning o’zida bir necha monomerlarni ligirlash imkoniyati bor, bularning natijasida oraliq k-o’lchovli konstruksiyalar olinadi. V- so’nggi bosqichda Golden Gate reaksiyasi o’tkaziladi, buning natijasida bir necha oraliq k-o’lchovli konstruksiyalarning va TALEN ning qolgan elementlarini o’zida tutgan “asos” plazmidalarning restriksiya va ligirlash hodisasi sodir bo’ladi.

In vitro sharoitlarda va bakteriya xujayralarida CRISP/Cas9 yordamida DNKni qirqish uchun quyidagi komponentlar talab etiladi va yetarli hisoblanadi: kodirlamaydigan RNK tracrRNA va pre-crRNA, RNKaza III va Cas9 oqsili. Ushbu tizimni sut emizuvchilar xujayralarida qo’llash bir qator afzalliklarni beradi.

Birinchidan, SpCase9 (Cas9 S. pyogenes) nukleazasi kodonlar tomonidan optimallashtirilgan yuqori eukariotlar xujayrasidagi transkripsiya jarayoniga moslashishi zarur hamda yadro kompartmentalizatsiyasini ta’minlash uchun yadro lokalizatsiyasi signallarini birlashtirish lozim (NLS- nuclear localization signal). Ikki NLS Cas9 ni yadroga samarali (effektiv) yo’naltirish uchun yetarlidir.
Ikkinchidan, eukariot xujayralarda pre-crRNA larni tayyor bo’lishi uchun ekzogen RNKaza III kiritilishi talab etilmaydi, chunki bu vazifani o’z xujayra RNKazalari samarali amalga oshiradi.
Uchinchidan, kodirlamaydigan ikki RNK o’rniga ko’pincha yagona ximerik sgRNA kiritiladi, bunda sintetik struktura “bigiz-asos” yordamida tabiiy crRNA-tracrRNA duplekslarni o’rnini bosish maqsadida yetuk crRNA tracrRNA qismi bilan birlashgan bo’ladi (4-rasm). sgRNA transkripsiyasi uchun mos keluvchi promotor talab etiladi, masalan RNK-polimeraza III aloqador U6- promotori.