Namangan davlat universiteti tabiiy fanlar fakulteti biologiya kafedrasi

Эритротситларни ювиш ва ишчи суспензияни тайёрлаш.

Қон плазма шаклли элементлардан, асосийси эритроцитлардан ташкил топган бўлади. Олинган қонни 1:10 нисбатда Рингер билан суюлтирилиб албатта коагулянт солган ҳолда, 3000 айланада 10 минут давомида центрифуга қилинади. Чўкма усти суюқлиги секин пипетка ёрадмида олинади (коагулянтсиз) Рингер эритмаси билан яна 2 марта такрорланади. 3 марта Рингер билан ювилган ҳужайралар 20-40 % га етиб қолади. Суспензиядаги гематокрит(суспензиянинг ҳажмий қисмини ташкил этиб, эритроцитлар билан % қисмларда шуғулланади) эритроцитларни аниқлаш учун яна 3000 айланада 3 минут давомида центрифугаланади. Бунинг учун одатий гематокрит капиллярлар, ёки 0.1 мл ўлчамли шиша пипетка кончикдан 10 м узоқликда кесилганини ишлатиш мумкин. Капиллярлар охири бирор бир пластилин билан беркитилган бўлиши керак. Ориқ пипеткалар билан ишлаганда қўл перчаткасидан олинган бармоқчалардан фойдаланиш тавсия этилади. Центрифугаланган суспензия аниқ икки қисмга ажралиб қолади: сувли ва қон (қизил). Гематокрит (Г) ҳужайра ҳажми фазаси билан (В) умумий ҳажм В(умумий) нинг фозиларда ифодаланган кўпайтмалари билан ифодаланади.

Г = В_кл / В_общ х 100% (1)

Суспензиядаги эритротситларнинг охирги концентрацияси 2-4% га келиб қолади. Эксперимент мақсадига қараб, 2-4% ҳужайра суспензиясини олиш учун шундай концентрацияли суспензияли тайёрланади. Масалан, агар тажриба давомида суспензия икки маротаба суюлтирилса, ички гематокрит 4-8% ни ташкил этади. Лекин агар у 10 марта суюлтирилса ички гематокрит 40-80% ни ташкил этади. Ҳужайра суспензиясининг охирги концентрациясига олиб келиш учун (4-40%) Рингер эритмаси керак бўлади.

1. 
   Аниқлаш йўли.
   

Микротитраторнинг ўйиқли платасида аниқлаш.
Микротитраторнинг 11 та ўйиқли платасига 200 мкл Рингер эритмаси солинади. Биринчи ўйиқ онтрол учун қолади. 2-ўйиққа аниқланаётган моддадан максимал концентрацияда солинади ва яхшилаб титрланади (10 мартадан кам бўлмаган ҳолатда). Кейин 2-ўйиқдан 200 мкл эритмадан олиб, 3-ўйиққа соламиз ва 5 марта титрлаймиз. Бу ишни қолган барча ўйиқларда такрорлаймиз. Бунинг натижаси ўлароқ, ҳамма ўйиқлардаги аниқланаётган ўйиқлардаги эритма концентрацияси қўшни эритма концентрациясидан 2 мартага фарқ қилади. Яна бу ўйиққа 1 % ли Тритон Х-100 эримасидан ҳужайрани тўлиқ гемолизлаш учун солинади. Тажриба уч марта ўтказилиши керак. Шунинг учун ҳамма проседурани яна 2 қаторда такрорлаш лозим. Ҳамма ўйиқларга 200 мкл 8%ли эритроцитлар суспензиясини солиш керак ва столнинг устки юзасида айлантириб аралаштириш лозим. Платани ойна билан ёпиб 37С⁰ да 30-60 минут давомида буғлатиш учун инкубация қилинади ва ҳар 10 минутда аралашитирилиб турилади. Ўйиқлардаги суюқликларни тоза 1.5 мл ли пробиркаларга олинади ва ҳар бирига 1 мл дан Рингер солиниб, 3000 айланада 10 минут центрифуга қилинади. Чўкма усти суюқлигини оптик зичлигини 540 нм да ўлчанади (максимал гемоглобин адсорбсияси). Гемолиз фоизи қуйидаги формуладан клетириб чиқарилади: (2)
Гемолиз = (ОП / ОП₁₀₀) х 100% (2)
ОП- бу тажрибадаги чўкма усти суюқлигининг оптик зичлиги; ОП₁₀₀- 3-ўйиқдаги тритон Х-100 детергенти билан чўкма усти суюқлигини ўртача оптик зичлиги. 3-контролний ўйиқдан ҳисобланган гемолиз берилган тажриба шароитлари билан спонтан гемолиз даражасини беради. Тажриба яхши олиб борилиши учун у бир неча фоизларга оширилмайди. Агар спонтан гемолиз даржаси юқори бўлса (5% га яқин), кир идишлардан фойдаланилган бўлади, ҳамда тажриба қайтадан қилиниши лозим, алоҳида эътиборни ишни тўғри кетишига қаратиш лозим