Mavzu: Gialuronidaza fermentidan lidaza preparatini olish. Mashg'ulot shakli: laboratoriya ishi Mashg'ulot mеtodi

Mavzu: Gialuronidaza fermentidan lidaza preparatini olish.
Mashg'ulot shakli: laboratoriya ishi
Mashg'ulot mеtodi: «klaser» usuli
Laboratoriya ishining maqsadi: Gialuronidaza fermentidan lidaza preparatini olishni o'rganish.
Mavzuning ahamiyati: fеrmеntlar, ularning xossalari va terapevtik maqsadlarda qo’llanishi haqidagi bilimlarni oshirish.


ISHNING NAZARIY QISMI:
Ferment preparatlari hozirgi vaqtda tibbiyotda, oziq – ovqat va engil sanoatning turli xil sohalarida o‘zining yanada ham ko‘proq qo‘llanish o‘rnini topmoqda. Ferment preparatlari ishlab chiqarishning muvaffaqiyatli rivojlanishi, fermentlarning tuzilishi, ta’sir mexanizmi va modda almashinuvidagi muhim rolini o‘rgatuvchi fan – enzimologiyaning yutuqlariga bog‘liq. Kimyoviy sintezning rivojlanganligiga qaramay bir qator muhim hayot uchun preparatlar faqatgina hayvon mahsulotlaridan olinadi. Bularga ko‘pchilik gormonlar va ferment preparatlari kiradi. Dori preparatlari olish uchun hayvon to‘qima va a’zolari, masalan, tripsin olish uchun qoramol oshqozon osti bezi, gialuronidaza ta’sirli preparatlar olish uchun qoramol a’zolaridan foydalaniladi.

Lidaza – bu tarkibida gialuronidaza fermentini saqlovchi preparat. Gialuronidaza fermentining spetsifik substrati gialuron kislota hisoblanadi. Gialuron kislota yuqori qovushqoqlikka ega bo‘lib, biriktiruvchi to‘qimani mustahkamlovchi modda ekanligi uning biologik faolligini ta’minlaydi. Gialuronidaza oqsillar bilan birikib xujayralararo moddasini hosil qiladigan mukopolisaxaridlarni depolimerlash xususiyatiga ega. Gialuronidaza ta’siri ostida to‘qima va devorlar o‘tkazuvchanligi ortadi, xujayralar biriktiruvchi to‘qima tomonidan suvni bog‘lash xususiyati o‘zgaradi, bo‘shliq va to‘qimalardagi ortiqcha suyuqliklarning limfatik hamda qon tomir tizimiga o‘tishi osonlashadi. Natijada ular organizmdan chiqib ketadi. Lidaza bo‘g‘im kontrakturalari, operatsiya va kuyishdan qolgan dog‘lar, gematoma va boshqa kasalliklarni davolashda, shuningdek teri osti va mushak ichiga kiritiladigan ba’zi dori moddalarini so‘rilishini tezlatishda ishlatiladi.

Gialuronidaza (gialuronitat − liaza) fermentining terapevtik maqsadlar uchun qo‘llanilishi, ayniqsa katta ahamiyatga ega. Keyingi yillarda organizmning patologik va fiziologik holatida gialuron kislota – gialuronidaza sistemasini o‘rganish tadqiqotlari yanada ko‘proq o‘ziga jalb qilmoqda. Gialuron kislota va gialuronidazaning organizmidagi qon tomir va to‘qimalar to‘siqlarini (barerlari) o‘tkazuvchanligini boshqarishdagi axamiyati katta. Gialuronidaza mikroorganizmlar agressivligini ifodalovchi omillardan biri va shu sababli qator infeksion kasalliklar patogenezida muhim ahamiyat kasb etadi.

Organizmda hosil bo‘ladigan to‘qima gialuronidazasi ham ba’zi bir agentlar ta’sirida patologik jarayon ketishiga muhim ta’sir ko‘rsatishi mumkin. Gialuron kislota – gialuronidaza preparatlari shu tizim qismlaridan birini buzilishini davolashda ishlatiladi.

Bu ferment preparatlari teri ostiga kiritilgan turli xil moddalar so‘ruvchanligini oshirish uchun qo‘llanib kelinadi, misol uchun tuzlarnng so‘rilishi tezlashtiradi. Ko‘pchilik holatlarda teri ostiga u yoki bu moddani gialuronidaza bilan birgalikda kiritilganda ayrim moddani vena ichiga kiritishga nisbatan yaxshiroq natijalar olinadi.Xususan, uni pediatriyada teri ostiga kiritish orqali qo‘llaniladi, misol uchun og‘riqli shishlarni yo‘qotish imkoniyatini beradi.

Preparat oftalmologiyada og‘riqsizlantirish samarasini kuchaytiradi, ginekologyada bachadon, bachadon bo‘yni erroziyasi va shamollash jarayonlarini davolashda ishlatiladi, maxalliy qo‘llaniladigan dori vositalarini ularning ta’sir zonasiga kirishini tezlashtiradi. Lidaza preparati parenteral qo‘llash uchun mo‘ljallangan mahsus tozalangan preparatdir.

Lidazaning anologik preparatlari chet davlatlarda quyidagi nomlar ostida chiqariladi: Alidase, Hyaluronidasum, Hyalase, Hyason, Hyasa, Invasinum, Spredine, Widase va boshqalar.

Lidaza kukuni och sarg‘ish yoki oltinsimon sarg‘ish rangli, suvda engil eruvchan g‘ovaksimon massani hosil qiladi. Lidaza steril quruq moddaning 64 shartli ta’sir birligi (SH.B.) ni saqlagan rezina tiqinli alyumin qopqoqli flakonlar shaklida chiqariladi.Qo‘llashdan oldin ampula ichidagi massa 1 ml 0,5 % li novokain eritmasida eritiladi.

Lidaza eritmasini jarohatlangan joy terisi ostiga yoki o‘zgargan to‘qima dog‘iga kiritiladi.In’eksiyalar har kuni yoki kun ora qilinadi, davolash kursi 6 – 10 – 15 ineksiyadan iborat. Davo samarasi chandiqlarni yumshashi, bo‘g‘imlarning xarakatchanligi oshishi, kontraturalar kamayishi yoki yo‘qolishi, gemotomalar so‘rilishi bilan kuzatiladi; davolash samarasi patologik jarayonning boshlanish bosqichlarida yaxshiroq namoyon bo‘ladi.

Lidazani revmatoid artritda elektroforez usuli bilan qo‘llanilishi ham keng yoritilgan. Lidazaning 64 SHB 30 ml distillangan suvda eritiladi, 4 – 5 tomchi 0,1 n li NSl eritmasi qo‘shiladi va suyultiriladi. Elektrod (anod) 2 bo‘g‘imga qo‘yiladi. Seansning davomiyligi 20-30 daqiqa; davolash kursi 10-15 seans.

Ko‘z kasallikdari amaliyotida lidazani qovoq jarohatlangan zonalari chandig‘ini yupqalashtirish uchun, keratitlarni davolash uchun qo‘llaniladi: 0,1% li eritma bir vaqtning o‘zida antibakterial preparatlar bilan birgalikda tomiziladi.

Preparat odatda yaxshi qabul qilinadi; ba’zan allergik teri reaksiyalari ro‘y berishi mumkin. Lidaza xavfli yangi o‘smalar, tuberkulyoz va infeksion kasalliklar, hamda yallig‘lanish jarayonida ishlatishga tavsiya etilmaydi.

LIDAZA OLISH UCHUN XOM ASHYO TAYYORLASH.
1.Uslubiy ta’minot:

1.Qoramol ko‘zi;

2.0,1 N sirka kislota;

3.Muzlatgich;

4. Pichoq ;

5. Taxta;

6. 50 ml stakan;

7. Menzurka;

8. Shisha tayoqcha.
Ishning olib borish tartibi:

Muzlatilgan 100 gr. xom ashyo (qoramol ko‘zi) zanglamaydigan pichoqda maydalaniladi. Maydalik darajasi o‘lchami 2-3 mm dan oshmasligi kerak. Maydalangan xom ashyoga – 4^oS li 12 ml 0,1N sirka kislota quyiladi. Ekstraksiya jarayoni 2 soat davom etadi. Ekstraksiyalash xar 10 daqiqada aralashtirib turilgan holda davom ettiriladi.

QORAMOL A’ZOSIDAN OLINGAN EKSTRAKT TARKIBIDAGI BIOFAOL MODDALARNI CHO‘KTIRISH VA ERITISH.
1. Uslubiy ta’minot:

1. – 5 ^oS da sovutilgan 50 ml. atseton;

2. 100 ml. stakan;

3. CHinni voronka;

4. SHisha tayoqcha;

5. 6 ta probirka;

6. Pipetka.
Ishning olib borish tartibi:
Sovutgichdagi ekstraktni filtrdan o‘tkaziladi. Ajratib olingan filtratni tiniqlashtirish maqsadida, 30 daqiqa sentrifugalanadi. So‘ngra tiniq ekstrakt ajratib olib, quyidagi ishlar bajariladi:

1. 
   0,5 ml. ekstraktga 2 ml xloroform qo‘shib aralashtiriladi.
   
2. 
   0,5 ml. ekstraktga 2 ml benzol qo‘shib aralashtiriladi.
   
3. 
   0,5 ml. ekstraktga 2 ml toluol qo‘shib aralashtiriladi.
   
4. 
   0,5 ml. ekstraktga 2 ml atseton qo‘shib aralashtiriladi.
   
5. 
   0,5 ml. ekstraktga 2 ml dis. suv qo‘shib aralashtiriladi.
   
6. 
   0,5 ml. ekstraktga 2 ml efir qo‘shib aralashtiriladi.
   

Bu ishlarni bajarishdan maqsad, ekstrakt tarkibidagi biofaol moddani cho‘ktirish. Buning uchun gialuronidaza fermenti organik erituvchida erimasdan cho‘kmaga tushishi kerak. Bunda erituvchi sifatida atseton tanlab olinadi. Ekstratga –5^oS 40 ml atsetondan tomchilab, aralashtirib turgan xolda 3^oS – 5^oS da 2 soat davomida qo‘shiladi. So‘ngra ekstrakt qopqog‘i zich yopilgan idishda qoldiriladi.

BIOFAOL MODDALARNI ERITISH JARAYONI.
1. Uslubiy ta’minot:

1. Sentrifuga;

2. Distillangan suv;

3. SHisha tayoqcha.

Ishning olib borish tartibi:

Ekstraktni sentrifugalab tarkibidagi kerakli modda ajratib olinadi. Eritish jarayoni 1 soat davom etadi. Bunda gialuronidaza fermenti suvda yaxshi eriganligi sababli, eritmaga erigan holda o‘tadi. Eritmadagi yot moddalar, yog‘lar cho‘kma xoliga o‘tadi. YOt moddalarni ajratib olish uchun filtrlanadi va sentrifugalanadi.

TOZA FERMENT OLISH UCHUN QAYTA CHO‘KTIRISH JARAYONI.

LIDAZA PREPARATINI OLISH.
1. Uslubiy ta’minot:

1. – 5 ^oS li atseton;

2. Shisha stakan;

3. Pipetka;

4. Filtr qog‘oz;

5. Sharli tegirmon ;

6. Elak.
Ishning olib borish tartibi:

Eritmadan gialuronidaza fementi ajratib olish uchun qayta cho‘ktirish jarayoni bajariladi. Bunda – 5 ^oS li 2 ml atsetondan foydalanamiz. Eritma tarkibidagi gialuronidaza fermenti cho‘kmaga tushadi. CHo‘kma filtrlash yo‘li bilan ajratib olinadi. CHo‘kma yanada toza maxsulot olish maqsadida yana atseton bilan yuviladi va xona xaroratida quritiladi. Bunda atseton uchib ketadi va quritilgan lidaza poroshogi sharli tegirmon tipidagi maydalagichlarda maydalaniladi. Maydalangan poroshok elakdan o‘tqaziladi. Elakdan o‘tmagani qaytadan maydalanadi. Natijada och sarg‘ish yoki oltinsimon sarg‘ish rangli modda – lidaza olinadi.

GIALURONIDAZA FERMENTINING FAOLLIGINI ANIQLASH.

Lidazaning gialuron faolligini gialuron kislotaning gidroliz reaksiyasi orqali aniqlanadi.

Lidazaning 3–5 ta flakoni olib, har bir flakonga 1 ml distillangan suv qo‘shiladi va hamma eritmalarni birlashtiriladi.Bir qator (8 – 10 ta) probirkalarga 0,5 ml suv solinadi, 1 – probirkaga 0,5 ml tekshirilayotgan lidaza eritmasi solinadi. Probirka yaxshilab aralashtiriladi va 1 – probirkadagi 0,5 ml aralashmani 2 – probirkaga solinadi va shu tariqa 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; va boshqa nisbatlar xosil qilinadi. Har bir probirkaga substrat gialuron kislotani ishchi dozasi solinadi (ishchi doza tajriba boshida tayyorlab qo‘yiladi) aralashtiriladi va probirkalarni shtativga qo‘yib 20 minutga 37^oS xaroratda termostatga qo‘yiladi. So‘ngra probirkalarni 2 – 3 daqiqa sovuq suvda sovitiladi. Har bir probirkaga 1 tomchidan (0,05 ml) 1% li albumin va 2 tomchidan (0,1 ml) 15% li sirka kislota solinadi. Gialuronidaza faolligi flakonda 64 va 128 shartli birligi oralig‘ida bo‘lishi kerak.
Gialuronidaza faolligining shkalasi.

(Mak – Klin va Mogilevskiy modifikatsiyasi bo‘yicha)

№ probirkalar	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Faolligi	2	4	8	16	32	64	128	250	500	1000	2000	4000

№ probirkalar	13	14	15	16	17	18
Faolligi	8000	16000	32000	64000	128000	256000

Substrat tayyorlash. Substrat inson kindigidan tayyorlanadi. Kindik ichaklari atsetonga solib qo‘yiladi va qon tomirlardan tozalanadi. YAna boshqa atsetonli idishga solinadi va refrijeratorda saqlanadi. Tozalangan ichakchalar filtr qog‘ozga o‘rab quritiladi va xona xaroratida qolgan atseton uchib ketgunicha qo‘yib qo‘yiladi.Ichakchalarni pichoq yordamida 1mm 2 o‘lchamda maydalanadi va tortib olinadi va 1:10 nisbatda suv solinadi va 30-40 minutda bo‘kish uchun qo‘yib qo‘yiladi. Hosil bo‘lgan moddani 1-2 daqiqa aralashtirib turgan holda past olovda qaynatiladi. Issiq holda paxta orqali filtrlab olinadi. Filtrat refrijeratorda 0 -6 ^oS xaroratda saqlanadi. Substratni 2-3 kun davomida ishlatsa bo‘ladi. Tajriba oldidan qovushqoqligi kerakli miqdorga etkaziladi. Tajriba uchun nisbiy qovushqoqligi 14-25^oS da 4,0–4,5 bo‘lgan substrat olinadi. Nisbiy qovushqoqligi kapillyar viskozimetr yordamida o‘lchanadi. (DF X1, 1t, 89 b).
Substratni ishchi miqdorini (doza) aniqlash.Ikkita probirkaga 0,5 ml dan suv va 1 – probirkaga 0,1 ml, 2 – probirkaga 0,2 ml gialuronidaza kislota substratidan solinadi. So‘ngra har bir probirkaga 1 tomchidan (0,05ml) 1% - li albumin eritmasidan solinadi va yaxshilab aralashtiriladi va 2 tomchi (0,1 ml) 15% li sirka kislota solinadi. Sirka kislota qo‘shilganda aniq loyqa cho‘kma hosil qilgan eng kichik miqdor ishchi doza qilib olinadi. CHo‘kma hosil qilmagan substrat tashlab yuboriladi.
Mustaqil bajarish uchun vazifalar:
1.Hayvon organlaridan ferment preparatlarini olish texnologiyasini o‘rganish.

2.Ferment preparatlarining sun’iy dori vositalaridan farqi va afzalliklari.

Nazorat uchun savollari:

1.Ferment preparatlariga ta’rif .

2.Gialuron kislota xossalari.

3.Gialuronidaza fermentining kimyoviy xossalari.

4.Gialuronidaza fermentining ishlatilishi.

5.Lidaza preparatining tibbiyotda ishlatilishi.

6.Lidaza preparati xossalari.

7.Hayvon organlarini tajribaga tayyorlash uchun qo‘yilgan talabalar.

LIDAZANI OLISH UCHUN XOM ASHYO TAYYORLASH. EKSTRAKSIYALASH.


Gialuronidaza fermenti



QORAMOL A’ZOSIDAN OLINGAN EKSTRAKT TARKIBIDAGI BIOFAOL MODDALARNI CHO‘KTIRISH. BIOFAOL MODDALARNI ERITISH JARAYONI.

Lidaza preparati


Adabiyotlar:

1. 
   Grachyova I.M. Texnologiya fermentnix preparatov. M: Fermenti. 1975.
   
2. 
   Elenov N.P. Osnovi biotexnologii. M: Nauka 1993.
   
3. 
   Mashkovskiy M.D. Lekarstvennie sredstva. T: Ibn Sino 1998.
   
4. 
   Fermentnie preparati iz jivotnogo sirya. Uchebno – metodicheskaya razrabotka. M: Meditsina 1978.