Luciana Almeida-Lopes

A primeira irradiação realizou-se em campo escuro, 12 h após o plaqueamento, quando havia confluência de 50% na maioria das placas, e posteriormente a cada 12 h num total de 4 sessões com fluência de 2 J/cm² por sessão. Como foram utilizados dois diferentes diodos laser (L1, L2), dividimos os grupos em três subgrupos correspondentes a:

GRUPO A1 = 9 placas = controle (sem irradiação)

A2 = 9 placas = irradiado com L1

A3 = 9 placas = irradiado com L2

Para os GRUPO B e C foram realizadas as mesmas subdivisões.

A contagem celular, em triplicata, realizou-se às 48, 96 e 144 horas após a 1ª irradiação. Os dados obtidos foram tratados estatisticamente.

Experimento 2
Na 9ª passagem as células foram tripsinizadas, centrifugadas, ressuspendidas em meio DME sem soro e semeadas em placas de 35 x 10 mm. A concentração celular para o seguinte plaqueamento foi de 1,7 x 10³ células/placa.

Utilizaram-se um total de 81 placas divididas aleatoriamente em 3 grupos de 27 placas, a saber:

Grupo A: meio DME sem soro fetal bovino

Grupo B: meio DME + 5% de soro fetal bovino

Grupo C: meio DME + 10% de soro fetal bovino

Foram utilizados o L3 e o L4 nos parâmetros demonstrados na Tabela 4.2.

Tabela 4.2: Parâmetros de irradiação de L3 e L4:

Energia total /sessão:	2 Joules	2 Joules
Área de irradiação	1 cm^2	1 cm^2
Tempo da irradiação/sessão	66 segundos	66 segundos
SAEF (dose/sessão)	2 J/cm^2	2 J/cm^2

A primeira irradiação realizou-se em campo escuro, 4 h após o plaqueamento, quando havia confluência de 50% na maioria das placas, e posteriormente a cada 12 h num total de 4 sessões com fluência de 2 J/cm² por sessão. Como foram utilizados dois diferentes diodos laser (L3, L4), dividiu-se os grupos em três subgrupos correspondentes a:

GRUPO A1 = 9 placas = controle (sem irradiação)

A2 = 9 placas = irradiado com L3

A3 = 9 placas = irradiado com L4

Para os GRUPO B e C foram realizadas as mesmas subdivisões.

A contagem celular, em triplicata, realizou-se às 48, 96 e 144 horas após a 1ª irradiação. Os dados obtidos foram tratados estatisticamente.

4.3.1. Curvas de Crescimento e de Viabilidade Celular

A contagem celular foi realizada para a obtenção de curvas de crescimento e de viabilidade celular, com finalidade de análise do efeito do laser sobre os fibroblastos.

Para o levantamento das células, as placas de cultivo foram lavadas duas vezes com PBSA e submetidas à tripsinização individualmente. O conteúdo de cada frasco foi removido, colocado em tubo de ensaio e centrifugado. O sobrenadante dos tubos foi aspirado e os precipitados foram ressuspendidos em 1 ml de PBSA e 0,1 ml dessa suspensão celular foi dispensada em um tubo de ensaio, sendo adicionado 0,8 ml de PBSA e 0,1 ml de Azul de Trypan a 0,4%¹. Fora do fluxo laminar, uma gota dessa mistura foi colocada em cada lado da Câmara de Neubauer, que foi levada ao microscópio invertido de fase para realização da contagem do número de células. Esse procedimento repetiu-se para cada placa estudada.

O número total de células foi registrado segundo a equação 4.1:

Equação 4.1:

N^o de células = N^o total de células contadas x diluição x 10⁴

N^o de quadrados usados para contagem
A exclusão das células coradas de azul, células mortas, da contagem geral serviu para a determinação do número de células viáveis (equação 4.2) e da porcentagem de viabilidade celular (equação 4.3).

Equação 4.2:

N^o de células viáveis = N^o total de células contadas (não coradas) x diluição x 10⁴

N^o de quadrados usados para contagem

O percentual de viabilidade da população celular foi obtido pela equação 4.3, segundo Freshney, 1990:

Equação 4.3: N^o total de células viáveis x 100

N^o total de células

As suspensões celulares restantes (0,9 ml de cada placa contada) não utilizadas na contagem, foram descartadas com jato de líquido de Dakin.

4.3.2. Análise Estatística
Os pontos das curvas de crescimento e de viabilidade celular representavam a média +/- o erro da média da contagem de 3 placas para cada período experimental. Os dados obtidos foram comparados por teste estatístico de análise de variância e complementado pelo teste de Tukey (SNEDECOR & COCHRAN, 1967) para comparação entre médias quando da presença de uma curva normal (Tabela 5.2 e 5.4). Foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis (Gomes, 1990) quando da presença de uma curva não normal, utilizando-se programa de informática⁷ (Tabela 5.6). As diferenças estatísticas foram consideradas significantes ao nível de 5% (p  0,05).

5. Resultados

5. Resultados

5.1. Linhagem LMF
Foi desenvolvida a linhagem celular LMF, fibroblastos originados de gengiva humana.

A monitoração do crescimento foi feita macroscopicamente observando-se se havia alteração na coloração e viscosidade do meio de cultivo. A cor do meio, a cada 4 dias tornava-se mais amarelada, significando alto metabolismo celular como conseqüência do consumo de nutrientes do meio. A troca de meio foi feita em média a cada 4 dias.

Também foi feita monitoração por meio de microscópio de observação direta a cada dois dias de forma rotineira, e observou-se que os cultivos alcançavam 100% de confluência a cada 7 dias. O crescimento dos cultivos foi uniforme e não foi verificado nenhum tipo de irregularidade nem contaminação (Tabela 5.1).

Tabela 5.1: Média da contagem celular para os diferentes grupos controles.

		Nº células x 10 ^3+ erro da média