Laboratoriya ishi. Toza virus preparatini olish usullari. Mashg’ulot maqsadi

5- rasm. Virusning sitopatik ta’siri. Morfologik o‘zgargan hujayralarning mikroskop ostida ko‘rinishi

Kiritmalar. Viruslar sitopatik ta’sirining ko‘rinishiga hujayra ichi kiritmalarining hosil bo’lishi ham kiradi. Agar virus hujayraiarni nobud qilmasa, kiritmalar hosil boladi yoki bo’lmasa ularning halok bo’lish bosqichiga yaqin hosil boladi. Kiritmalarning hosil bo’lishi virusga qarshi hujayra reaksiyasining yagona ko‘rinishi bo’lishi ham mumkin.
Hujayra kulturasining latent virusli infeksiyasida virus reproduksiyalanadi, lekin sitopatik ta’sir kuzatilmaydi.
Hujayra transformatsiyasi hujayra kulturalarini onkogen viruslar bilan zararlaganda yuzaga keladi, bunda virus ta’sirida hujayralar to‘xtovsiz ko‘payadi va bir necha qavat hosil qilib, tartibsiz o‘sadi. Bunday kultura yuqtirilgan hayvonlarda xavfli o‘smalar paydo bo’lishi mumkin.
Sitopatik ta’sirga ko‘ra virusni indikatsiya qilish. Bemordan olingan materialda virusni aniqlash maqsadida tekshiriluvchi material bir qavatli hujayra kulturasiga yuqtiriladi. Yuqtirish uchun hujayra qatlarni tekis o‘sgan probirkalardan foydalaniladi. Ularni mikroskopning kichik obyektivida ko‘riladi. Zararlashdan oldin probirkadan kultura suyuqligi so‘rib olinadi, so'ngra 0,1 ml tekshiriluvchi material solinadi va unga oziq muhit (zardobsiz, qo’llab turuvchi) 1ml gacha qo‘shiladi. Har bir material sinamasi 4 ta probirkaga solinadi. Nazorat uchun bir necha probirkalar zararlantirilmaydi. Lekin ularga ham oziq muhit qo‘shiladi. Probirkalar termostatda, odatda, 37° С da saqlanadi va har kuni sitopatik ta’simi aniqlash maqsadida mikroskopda ko‘riladi (1 hafta mobaynida va undan ham ko‘proq).
Hujayra qavatidagi degenerativ o‘zgarishlar ikkita plyusdan («++») kam bo‘lmagan holatlarda tekshiriluvchi materialda virus bor deb hisoblanadi.
Har bir virusning hujayra kulturalariga sitopatik ta’siri (agar turli turdagi kulturalar bo‘lsa ham) ma’lum bir maxsuslikka egadir. Odatda, qarindosh bo’lgan viruslarning sitopatik ta’siri o‘xshash bo‘ladi, turli xususiyatga ega bo‘lgan viruslar sitopatik ta’siri esa, bir-biridan farq qiladi. Shu tufayli sitopatik ta’siriga ko‘ra tekshiriluvchi virusning qaysi oilaga yoki turga kirishi haqida xulosa qilish mumkin.
Masalan, enteroviruslar (polio’lielit virusi, Koksaki, ESHO) sitopatik ta’siriga hujayralarning mayda donador destruksiyasi xarakterli bo‘lib, bunda hujayralar yumaloq shaklni oladi va bir xil tartibda joylashadi. Adenoviruslar sitopatik ta’siri uchun hujayra qavatining mayda, yumaloq hujayralar to‘plarniga aylanishi xarakterli bo‘lib, hujayralar uzum shingiliga o‘xshab joylashadi. Paragripp viruslar, respi­rator - sintsitial, qizamiq va tepki viruslarining sitopatik ta’siri simplastlar hosil bo‘lishi bilan kechadi.
Sitopatik ta’siriga ko‘ra viruslarni titrlash. Tekshiriluvchi materialdagi virusning miqdori titrlash yordamida aniqlanadi. Buning uchun virusning ketma-ket 10 martagacha suyultirilgan eritmalari tayyorlanib olinadi va bu suyultirilmalar bilan hujayra kulturalari zararlantiriladi (har bir suyultirilrha uchun 4 tadan probirka olinadi). Sitopatik ta’siri bo‘yicha virusni titrlash uslubi yuqorida keltirilgan sitopatik ta’siri bo‘yicha virusni aniqlash usullaridan deyarli farq qilmaydi.
Virusning titri deb, zararlangan kulturaning yarmida sitopatik ta’sir chaqiradigan virusning eng katta suyultirish darajasiga aytiladi (ya’ni virusning 4 ta probirkadagi suyultirilmasidan hech bo'lmaganda ikkitasida sitopatik ta’sir kuzatilishi lozim). Virusning titri Rid va Mench usuli bo‘yicha aniqlanadi. Virusning titri 1 ml dagi sitopatik dozalarda ko‘rsatiladi (SPT₅₀). Bir SPT₅₀ uchun titrlab suyultirilgan 0,1 ml virus tutuvchi material qabul qilingan.
Ajratib olingan virusni sitopatik ta’sirini neytrallash bo‘yicha identifikatsiyalash. Probirkadagi hujayra kulturasiga tekshiriluvchi material yuqtiriladi, sitopatik ta’sir ko‘rsatgandan so‘ng probirkadagi hujayra suyuqligi identifikatsiyalash uchun virus saqlovchi material sifatida olinadi.
Tajribani qo‘yish uchun kultural suyuqlik (virusning ma’lum SPD₅₀ dozasi bilan) diagnostik immun zardob bilan teng miqdorda aralashtiriladi (zardobning 1:5 yoki 1:10 suyultirilmalari olinadi). Xona haroratida 1-2 soat turgandan so‘ng, bu aralashma bilan (0,2 ml dan) oldindan oziq muhiti to'kib tashlangan 4 ta probirkadagi hujayra kulturasi zararlantiriladi; aralashma qo‘shilgandan so‘ng probirkaga 0,8 ml dan yangi oziq muhit quyiladi. Odatda, kultural suyuqlik sinamasi bir vaqtda bir nechta turga xos zardoblar bilan tekshiriladi. Tajriba bir nechta nazoratlar bilan olib boriladi:

• 
  Zararlanmagan kultura nazorati;
  
• 
  Virus dozasining nazorati — hujayra kulturalari tajribadagidek virus dozasi bilan zararlantiriladi;
  
• 
  Kultural suyuqlik va me’yoriy zardob aralashmasi bilan zararlangan kultura nazorati.
  

Tajriba natijasi 5-7 va undan ko'proq kundan so‘ng, probirkalarni mikroskopning kichik obyektivi ostida ko‘rish bilan baholanadi. Birinchi nazoratda SPT bo‘lmasligi kerak, ikkinchi va uchinchisida albatta SPT hosil bo’lishi kerak. Tajriba probirkalarida sitopatik ta’siming bo’lmasligi bu probirkada virusning immun zardob bilan neytralizat­siyasi sodir bo’lganligidan dalolat beradi, bundan tashqari zardob ajratib olingan virus turiga mos keladi.
Shunga o'xshash tarzda bemor zardobida virusneytrallovchi antitelalarni titrlash ham olib boriladi. Tekshirilayotgan zardobning ikki marotaba syyultirilgan darajalari tayyorlanadi va ularning har biri maMum virusning standart dozalari (100, 1000 SPD₅₀) bilan
aralashtiriladi, 1-2 soatlik inkubatsiyadan so‘ng aralashma bilan hujayra kulturalari zararlantiriladi.