Курсовая работа по фармакогнозии «лекарственное растительное сырье, содержащее дубильные вещества»

Глава 2. Фитохимический анализ лекарственного растительного сырья, содержащего дубильные вещества

1. 
   Качественный анализ исследуемой группы БАВ
   

Все качественные реакции, которые осуществляются для идентификации дубильных веществ можно подразделить на 2 категории: реакции осаждения и хромогенные (цветные) реакции [7, 10, 18].

Реакции осаждения:
1) При взаимодействии дубильных веществ с 1% раствором желатина, приготовленном на 10% растворе натрия хлорида, образуется осадок или возникает помутнение раствора. При добавлении избытка желатина помутнение исчезает.
2) Танниды дают обильные осадки с алкалоидами (кофеин, пахикарпин, 1% раствор хинина хлорида - появляется аморфный осадок за счет образования водородных связей между гидроксильными группами дубильных веществ и атомами азота алкалоида), а также некоторыми азотистыми основаниями (уротропин, новокаин, дибазол).
3) При взаимодействии с 10% раствором уксуснокислого свинца – (CH₃COO)₂Pb дубильные вещества гидролизуемой группы образуют хлопьевидный осадок.
4) Дубильные вещества конденсированной группы образуют хлопьевидный осадок в реакции с бромной водой.
Цветные реакции:
1) Дубильные вещества гидролизуемой группы с раствором железоаммонийных квасцов образуют черно-синие окрашенные соединения, а конденсированной группы - черно-зеленые.
2) Если в растении одновременно содержатся дубильные вещества и гидролизуемой и конденсированной группы, то вначале гидролизуемые таниды осаждают 10% раствором ацетата свинца, осадок отфильтровывают, а затем проводят реакцию фильтрата с раствором железоаммонийных квасцов. Появление темно-зеленой окраски свидетельствует о наличии веществ конденсированной группы.
Групповые качественные реакции на дубильные вещества представлены в таблице 2 [10, 18, 21]: 
Таблица 2. Реактивы и эффекты реакций на дубильные вещества различных групп

№	Реактив	Гидролизуемые танниды (эффект)	Конденсированные танниды (эффект)
1	разбавленная кислота серная	Гидролиз	Красно-коричневые флобафены (красени)
2	бромная вода (5г брома в 1 л воды)	Отсутствует	Оранжевый или желтый осадок
3	1 % раствор квасцов железоаммонийных (железа окисного хлорид не используют, т.к. его раствор имеет кислую реакцию среды)	Черно-синее окрашивание или осадок	Черно-зеленое окрашивание или осадок
4	10 % раствор свинца среднего ацетата (одновременно добавляют 10 % раствор кислоты уксусной)	Белый осадок, нерастворимый в кислоте уксусной (осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание конденсированных таннидов, с 1 % раствором квасцов железоаммонийных - черно-зеленое окрашивание)	Белый осадок, растворимый в кислоте уксусной
5	проба Стиасни (40 % раствор формальдегида с концентрированной кислотой хлористоводородной)	Отсутствует	Осадок кирпично-красного цвета (осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание гидролизуемых таннидов, в нейтральной среде с 1 % раствором квасцов железоаммонийных - черно-синее окрашивание)
6	1 % раствор ванилина в концентрированной кислоте хлористоводородной	Отсутствует	Оранжево-красное окрашивание (катехины)

2. 
   Методики количественного определения дубильных веществ
   

Согласно ОФС.1.5.3.0008.18 «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» определение содержания дубильных веществ проводят титриметрическим (перманганатометрическим) и/или спектрофотометрическим методами [8].

Титриметрический метод заключается в определении суммы дубильных веществ в пересчете на танин, а спектрофотометрический метод позволяет определять сумму дубильных веществ в пересчете на пирогаллол или (+)-катехин в зависимости от группы дубильных веществ (гидролизуемые или конденсируемые соответственно), если в фармакопейной статье не указан другой стандартный образец [4, 8, 27].
Арбитражным методом определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах является спектрофотометрический метод.
Метод 1. Определение суммы дубильных веществ в пересчете на танин:
Около 2 г (точная навеска) измельченного лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 3 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья/препарата не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 25,0 мл полученного водного извлечения помещают в коническую колбу вместимостью 1000 мл, прибавляют 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания.
Параллельно проводят контрольный опыт: в коническую колбу вместимостью 1000 мл помещают 525 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания.
1 мл 0,02 М раствора калия перманганата соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин.
Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на танин в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле, указанной на рисунке:

Рисунок 16. Расчет количественного содержания дубильных веществ, Х% (в пересчете на танин) перманганатометрическим методом.
Метод 2. Определение суммы дубильных веществ спектрофотометрическим методом – арбитражный метод [4, 8, 21]:
Около 2,0 г (точная навеска), если иное не указано в частной фармакопейной статье, измельченного лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм, отбрасывая первые 50 мл фильтрата.
Раствор А. 1,0 мл фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора А (А₁) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.
Раствор Б. К 5,0 мл фильтрата прибавляют 0,05 г кожного порошка, перемешивают полученную смесь в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм. 1,0 мл полученного фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность раствора Б (А₂) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.
Раствор СО. 0,1 г (точная навеска) СО пирогаллола (для гидролизуемых дубильных веществ) или (+)-катехина (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. Измеряют оптическую плотность раствора СО (А₃) на спектрофотометре при длине волны 266 нм (для гидролизуемых дубильных веществ) или 278 нм (для конденсированных дубильных веществ), если иное не указано в фармакопейной статье, в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют воду.
Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на пирогаллол или (+)-катехин в абсолютно сухом лекарственном растительном сырье или лекарственном растительном препарате в процентах (Х) вычисляют по формуле, указанной на рисунке 17, где:
A₁ – оптическая плотность раствора А;
A₂ – оптическая плотность раствора Б;
A₃ – оптическая плотность СО пирогаллола или (+) – катехина;
a – навеска лекарственного сырья или лекарственного растительного препарата, г;
a_o – навеска СО пирогаллола или (+) – катехина, г;
P – содержание основного вещества в СО пирогаллола или (+) – катехина,%
W – влажность лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, %.

Рисунок 17. Формула расчета количественного содержания дубильных веществ спектрофотометрическим методом
Согласно литературным данным, развивающимся и перспективным методом анализа дубильных веществ является кулонометрия. Сущность данного способа описана на примере количественного определения исследуемой группы БАВ дубровника белого (Teucrium polium) [1, 22].
Описание: В электролитическую ячейку на 50,0 мл вводят 20-25 мл фонового электролита, помещают рабочий (платиновый), вспомогательный (платиновый) и индикаторные электроды (платиновые игольчатые электроды). Включают генераторную и индикаторную цепи.
При достижении индикаторным током определенного значения в ячейку вводят аликвоту исследуемого образца (0,4-0,5 мл) и одновременно включают секундомер. Величина разности потенциалов, накладываемая на индикаторные электроды, составляет 300 мВ. Конечную точку титрования фиксируют по достижению индикаторным током первоначального значения. Выключают секундомер и отключают индикаторную цепь. Определение проводят при комнатной температуре.
Электрогенерацию йода проводили из 0,1 М раствора йодида калия в фосфатном буферном растворе (рН = 9,8) на платиновом электроде при постоянной силе тока 5,0 мА.
Содержание дубильных веществ в лекарственном растительном сырье в пересчете на танин (X, %) рассчитывают по формуле, отраженной на рисунке:

Рисунок 18. Формула расчета кулонометрического определения содержания дубильных веществ в растительных объектах
Условные обозначения:
I - сила тока, A;
t - время достижения конечной точки титрования, с;
41,57 - условная величина молярной массы эквивалента танина, г/моль; а - навеска сырья, г;
Va - объем аликвоты, вводимый в кулонометрическую ячейку, мл;
250 - объем водного извлечения из лекарственного растительного сырья, мл;
W - потеря в массе при высушивании, %;
F - постоянная Фарадея 96485 Кл/моль.