Курсовая работа кинетика ферментативных реакций

3. Некоторые устройства, удобные для определения начальных скоростей реакции

К определению начальных скоростей реакций (v₀) приводят многие задачи ферментативной кинетики. Основное достоинство этого метода в том, что определяемые в начальный момент времени значения v₀ будут давать наиболее точные представления об активности изучаемых ферментов, поскольку накапливающиеся продукты реакции не успевают еще оказывать ингибирующего влияния на фермент и, кроме того, реагирующая система находится в состоянии стационарного равновесия.

В лабораторной практике, однако, при использовании обычной спектрофотометрической, титриметрической или другой техники регистрации протекания таких реакций теряется в лучшем случае до 15–20 с начального времени на внесение фермента к субстрату, перемешивание реагирующей системы, установку ячейки и т.п. А это недопустимо, так как касательная в этом случае приводится уже в точку, где tg ά₂ < tg ά₁. Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v₀ на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без постоянного перемешивания осложняется еще и флуктуациями концентраций реагентов по объему.
Предлагаемые ниже простые устройства к спектрофотометру, рН-метру и тому подобному позволяют в значительной мере снизить источники указанных погрешностей определения v₀. [1]


3.1 Устройство к спектрофотометру

Устройство к спектрофотометр состоит из дозатора 1, вращающейся тефлоновой нити 2 (мешалка) и крышки-фиксатора 3.

Дозатор – это микропипетка, один конец которой оформляется иглой 4, второй – уширением 5 (для предотвращения попадания фермента в резиновый наконечник 6).
В тефлоновой крышке 3, закрывающей спектральную кювету 7, имеются два отверстия: одно (8) в центре крышки, второе (9) над серединой промежутка между непрозрачной стенкой кюветы 7 и лучом света 10. Тефлоновая трубка 11 (внутренний диаметр 1 –1,5 мм) одним концом закрепляется в отверстии 9, вторым – на неподвижном выступе 12 перед ротором мотора 13. Внутрь трубки вводится тефлоновая нить 2 (толщина нити 0,5–0,6 мм). Один конец нити укрепляется на вращающемся роторе мотора 13, второй – пропущенный в кювету 7 – оформляется в виде спирали (для усиления перемешивания). Положение нити определяет крышка-фиксатор 3 вне зависимости от удаления мотора, что удобно при работе, требующей частой смены кювет.
Принцип работы. Кварцевая кювета спектрофотометра 7 наполняется субстратом 14 (около 1,5–2,0 мл), вставляется в термостатический кюветодержатель спектрофотометра, закрывается крышкой 3 с вращающейся тефлоновой нитью 2, которая погружается в субстрат 14, и все дальнейшие операции выполняются уже в луче света спектрофотометра и регистрируются на самописце.
В начале работы осуществляется перемешивание субстрата, и перо самописца пишет ровную горизонтальную (или «нулевую») линию. Дозатор (с ферментом) вставляется в отверстие 8 (игла погружается в раствор субстрата 14), быстрым сдавливанием наконечника 6 фермент (обычно около 0,03–0,05 мл) вводится в субстрат, и дозатор удаляется. Перемешивание компонентов заканчивается за 2,5–3 с, и перо самописца фиксирует начало реакции отклонением кривой зависимости оптической плотности (ΔА) от времени.
Такое приспособление позволяет также отбирать пробы из реагирующей системы на анализ; вносить в систему добавки ингибиторов и активаторов; изменять условия протекания реакций (изменять рН, ионную силу и т.п.) без нарушения регистрации хода реакций, что оказывается очень удобным, например, при исследовании расщепления n-НФФ «кислыми» фосфатазами, где расщепление n-НФФ проводят при рН 5,0 (или рН 6–7), а активность ферментов определяют по накоплению n-нитрофенолят ионов при рН 9,5–10,0. [4]
Удобно такое устройство и для проведения спектрофотометрического титрования ферментов и т.п.