Kurs ishining maqsadi : genomni tahrirlashning asosiy usullarini o'rganishdir. Ushbu maqsad bilan bog'liq holda biz quyidagi vazifalarni

2.3.
 
Boshqariladigan genomni tahrirlash 
CRISPR-Cas9 tizimining keyingi takomillashuvlari va variantlari undan 
foydalanishda ko'proq nazoratni joriy etishga qaratilgan. Xususan, ushbu tizimni 
takomillashtirishga qaratilgan tadqiqotlar uning o'ziga xosligini, samaradorligini va 
tahrirlash qobiliyatining nozikligini oshirishni o'z ichiga oladi. Texnikalarni 
qo'shimcha ravishda ular o'zgartiradigan tizim komponentiga qarab ajratish va 
tasniflash mumkin. Bularga Cas oqsilining boshqa variantlari yoki yangi 
yaratilishlaridan foydalanish, umuman boshqa effektor oqsilidan foydalanish, 
sgRNKni o'zgartirish yoki mavjud optimal echimlarni aniqlash uchun algoritmik 
yondashuvdan foydalanish kiradi.
O'ziga xoslik CRISPR-Cas9 tizimini 
takomillashtirishning muhim jihati hisoblanadi, chunki u yaratadigan maqsaddan 
tashqari ta'sir hujayra genomi uchun jiddiy oqibatlarga olib keladi va undan 
foydalanishda ehtiyot bo'lishni talab qiladi. Maqsaddan tashqari ta'sirlarni 
minimallashtirish tizimning xavfsizligini maksimal darajada oshiradi. O'ziga 
xoslikni oshiradigan Cas9 oqsillarining yangi o'zgarishlari avvalgi maqsadsiz 
ketma-ketliklarni nishonga olishga qodir bo'lgan original SpCas9 bilan solishtirish 
mumkin bo'lgan samaradorlik va o'ziga xoslikka ega effektor oqsillarni va 
maqsaddan tashqari mutatsiyalarga ega bo'lmagan variantni o'z ichiga oladi. 
Shuningdek, yangi Cas9 oqsillarini yaratish boʻyicha tadqiqotlar olib borildi, 
jumladan, baʼzilari crRNKdagi RNK nukleotidlarini DNK bilan qisman 
almashtiradi va strukturaga asoslangan Cas9 mutantlarini yaratish protsedurasi, 
ularning barchasi maqsaddan tashqari taʼsirlarni kamaytiradi. maqsaddan tashqari 
ta'sirlarni ham kamaytirish. Hisoblash usullari, shu jumladan mashinani o'rganish, 
berilgan maqsadlar uchun o'ziga xoslikni oshirish uchun tizimning yaqinligini 
bashorat qilish va noyob ketma-ketliklarni yaratish uchun ishlatilgan. 
CRISPR-Cas9 ning bir nechta variantlari yorug‘lik yoki kichik molekulalar kabi 
tashqi trigger yordamida genni faollashtirish yoki genomni tahrirlash imkonini 
beradi. Bularga yorug‘likka sezgir oqsil hamkorlarini faollashtiruvchi domen va 
gen faollashuvi uchun dCas9 bilan birlashtirish yoki sintez qilish orqali ishlab 

---

20 
chiqilgan fotoaktiv CRISPR tizimlari kiradi. Split-Cas9 ning ikkita konstruktsiyasi 
bo'lgan shunga o'xshash yorug'likka sezgir domenlar yoki Cas9 tarkibiga qafasli 
tabiiy bo'lmagan aminokislotalarni kiritish yoki genomni tahrirlash uchun foto 
bo'linadigan qo'shimchalar bilan hidoyat RNKni o'zgartirish orqali. 
Kichkina molekulalar yordamida genomni tahrirlashni nazorat qilish usullariga 
allosterik Cas9 kiradi, fon tahriri aniqlanmaydi, u 4-gidroksitamoksifen (4-HT), 4-
HT-ga javob beradigan Cas9 yoki Cas9 qo'shilishi bilan bog'lanish va 
parchalanishni faollashtiradi. Bu to'rtta ERT2 domeniga birlashtirilganda 4-HT 
javob beradi. Intein-inducible split-Cas9 Cas9 fragmentlarini dimerizatsiya qilish 
imkonini beradi va split-Cas9 ning ikkita konstruktsiyasini FRB va FKBP 
fragmentlari bilan birlashtirish orqali ishlab chiqilgan rapamisin-induktsiyali split-
Cas9 tizimi. Boshqa tadqiqotlar Cas9 ning kichik molekula, doksiklin bilan 
transkripsiyasini qo'zg'atishi mumkin edi. .Kichik molekulalar, shuningdek, 
gomologik yo'naltirilgan tuzatishni yaxshilash uchun ham ishlatilishi mumkin, 
ko'pincha gomologik bo'lmagan uchi qo'shilish yo'lini inhibe qilish orqali. VE-822 
va AZD-7762 kichik molekulalari tomonidan induktsiya qilingan Cpf1 effektor 
oqsiliga ega tizim yaratildi. Ushbu tizimlar aniqlik, samaradorlik va fazoviy vaqt 
nazoratini yaxshilash uchun CRISPR faoliyatini shartli boshqarish imkonini 
beradi. Fazoviy vaqt nazorati maqsaddan tashqari ta'sirlarni yo'q qilish shaklidir - 
faqat ma'lum hujayralar yoki organizmning qismlarini o'zgartirish kerak bo'lishi 
mumkin va shuning uchun yorug'lik yoki kichik molekulalar buni amalga oshirish 
usuli sifatida ishlatilishi mumkin. CRISPR-Cas9 tizimining samaradorligi oqsillar 
va zarur reagentlarni yaratish uchun DNK ko'rsatmalarini to'g'ri etkazib berish 
orqali ham sezilarli darajada oshadi.
CRISPR, shuningdek, maqsadli ketma-
ketlikda bir yoki ikkita bazada maxsus tahrirlarni yaratish uchun bitta tayanch-juft 
tahrirlovchi oqsillardan foydalanadi. CRISPR/Cas9 o'ziga xos fermentlar bilan 
birlashtirilgan bo'lib, dastlab faqat C ni T ga va G ni A ga va ularning teskarisiga 
o'zgartira oladi. Bu oxir-oqibat hech qanday DNK parchalanishini talab qilmasdan 

---

21 
amalga oshirildi. Boshqa fermentning sintezi bilan CRISPR-Cas9 bazasini 
tahrirlash tizimi C dan G ga va uning teskarisini ham tahrirlashi mumkin. 
Klasterli muntazam intervalgacha qisqa palindrom takrorlash (CRISPR)/Cas9 
tizimi genni tahrirlash texnologiyasi bo'lib, u har qanday joyda qo'sh zanjirli 
uzilishlarni (DSB) keltirib chiqarishi mumkin bo'lgan hidoyat ribonuklein 
kislotalari (gRNK) protospacer qo'shni motiv (PAM) ketma-ketligi bilan 
bog'lanishi mumkin.[105 ] Yagona zanjirli niklarni Cas9 nikkazalari deb ham 
ataladigan faol sayt mutantlari ham qo'zg'atishi mumkin. Oddiygina gRNK ketma-
ketligini o'zgartirish orqali Cas9-endonukleaza qiziqish geniga yetkazilishi va DSB 
ni keltirib chiqarishi mumkin. Cas9-endonukleazning samaradorligi va genlarni 
maqsadli yo'naltirishning qulayligi sichqoncha va inson hujayralari uchun 
CRISPR-nokaut (KO) kutubxonalarining rivojlanishiga olib keldi, ular 
qiziqishning o'ziga xos gen to'plamlarini yoki butun genomni qamrab olishi 
mumkin. CRISPR skriningi olimga tirik model organizmlar ichida tizimli va 
yuqori o'tkazuvchan genetik buzilishni yaratishga yordam beradi. Ushbu genetik 
buzilish gen funktsiyasi va epigenetik tartibga solishni to'liq tushunish uchun 
zarurdir. Birlashtirilgan CRISPR kutubxonalarining afzalligi shundaki, bir 
vaqtning o'zida ko'proq genlarni yo'naltirish mumkin. 
Nokaut kutubxonalari barcha ifodalangan gRNKlar boʻylab teng koʻrinish va 
unumdorlikka erishish uchun yaratilgan va transduktsiya qilingan hujayralarni 
qayta tiklash uchun ishlatilishi mumkin boʻlgan antibiotik yoki lyuminestsent 
tanlash belgisini olib yuradi. CRISPR/Cas9 kutubxonalarida ikkita plazmid tizimi 
mavjud. Birinchidan, barchasi bitta plazmidda bo'lib, u erda sgRNK va Cas9 bir 
vaqtning o'zida transfektsion hujayrada ishlab chiqariladi. Ikkinchidan, ikki 
vektorli tizim: sgRNK va Cas9 plazmidlari alohida-alohida yetkazib beriladi. 
Infektsiyaning past ko'pligida (MOI, odatda 0,1-0,6 da) virusli transduktsiya yo'li 
bilan hujayralarning bir idishiga minglab noyob sgRNK o'z ichiga olgan 
vektorlarni etkazib berish muhimdir. ), bu alohida hujayra klonining bir nechta 

---

22 
sgRNK turini olish ehtimolini oldini oladi, aks holda bu genotipning fenotipga 
noto'g'ri tayinlanishiga olib kelishi mumkin. 
Birlashtirilgan kutubxona tayyorlangandan so'ng, sgRNKlarning ko'pligini 
aniqlash uchun PCR bilan kuchaytirilgan plazmid DNKning chuqur ketma-
ketligini (NGS, keyingi avlod sekvensiyasi) amalga oshirish kerak. Qiziqarli 
hujayralar kutubxona tomonidan zararlangan bo'lishi mumkin va keyin fenotipga 
ko'ra tanlanishi mumkin. Tanlovning 2 turi mavjud: salbiy va ijobiy. Salbiy tanlov 
natijasida o'lik yoki sekin o'sadigan hujayralar samarali tarzda aniqlanadi. U omon 
qolish uchun zarur bo'lgan genlarni aniqlashi mumkin, ular keyinchalik molekulyar 
maqsadli dorilarga nomzod bo'lib xizmat qilishi mumkin. Boshqa tomondan, 
musbat tanlanish tasodifiy mutagenez orqali o'sish afzalligi olingan populyatsiyalar 
to'plamini beradi.[105] Tanlovdan so'ng genomik DNK yig'iladi va NGS 
tomonidan ketma-ketlashtiriladi. SgRNKning kamayishi yoki boyitishi aniqlanadi 
va sgRNA mos keladigan maqsadli gen bilan izohlangan asl sgRNK kutubxonasi 
bilan taqqoslanadi. Statistik tahlil keyinchalik qiziqish fenotipiga sezilarli darajada 
mos keladigan genlarni aniqlaydi 
Nokautdan tashqari, nok-down (CRISPRi) va faollashtirish (CRISPRa) 
kutubxonalari ham mavjud bo'lib, ular proteolitik tarzda o'chirilgan Cas9- 
termoyadroviy oqsillarning (dCas9) maqsadli DNKni bog'lash qobiliyatidan 
foydalanadi, ya'ni qiziqish gen kesilmaydi, lekin. haddan tashqari ifodalangan yoki 
bostirilgan. Bu CRISPR/Cas9 tizimini genlarni tahrirlashda yanada qiziqarli qildi. 
Faol bo'lmagan dCas9 oqsili dCas9-repressorlari yoki aktivatorlarini maqsadli 
genlarning promotor yoki transkripsiyali boshlang'ich joylariga yo'naltirish orqali 
gen ekspressiyasini modulyatsiya qiladi. Genlarni bostirish uchun Cas9 gRNK 
bilan kompleks hosil qiluvchi KRAB effektor domeniga birlashtirilishi mumkin, 
CRISPRa esa turli transkripsiya faollashtirish domenlari bilan birlashtirilgan dCas9 
dan foydalanadi, bu esa gRNK tomonidan ekspressiyani tartibga solish uchun 
promotor hududlarga yo'naltiriladi. 

---

23 
XULOSA 
Genomni tahrirlashning asosiy usullarini o'rganib chiqib, quyidagi xulosalar 
chiqarishimiz mumkin.
Induktsiyalangan mutagenez va induktsiyalangan 
poliploidizatsiya juda uzoq vaqtdan beri ma'lum, ammo ular hali ham talabga ega. 
Genomik tahrirlashning asosiy usullaridan hozirda ARCUT qaychi amalda 
qo'llanilmaydi, kimerik oligonukleotidlar, meganukleazlar, ZF va TALEN 
texnologiyalari kamdan-kam qo'llaniladi, chunki ular CRISPR / Cas 
texnologiyasidan "o'tib ketgan", ularning asosiy afzalliklari nisbiydir. tayyorgarlik 
jarayonlarining soddaligi va tezligi 
Shu bilan birga, genomga kiritilgan o'zgarishlarning aniqligi ushbu 
texnologiyaning turli xil takomillashuvlari tufayli ancha yuqori. 
Biroq, Garvard olimlari DNKni tahrirlashning yangi usulini taklif qilishdi - "asosiy 
tahrirlash usuli". Uni turli turdagi inson hujayralarida sinab ko'rgan 
tadqiqotchilarning fikriga ko'ra, bu usul CRISPR/Cas9 ga qaraganda aniqroq 
ishlaydi. 

---

24