Kurs ishi mavzu: Proteomika fani va uning istiqbollari. Bajardi: Sobirova Sadoqat Qabul qildi : Babajanov Ilyor Tojibayevich Urganch 2022

Vester-blotting usuli


Ba'zi hollarda, ajratilgan antikorlarning qaysi hujayra oqsillari bilan o'zaro ta'sir qilishini aniqlash kerak. Ko'pincha teskari muammo bor: izolyatsiya qilingan oqsilni unga maxsus bog'laydigan antikorlar yordamida aniqlash mumkin. Buning uchun Western blotting yoki immunoblotting usuli mavjud. U qo'llanganda, o'rganilayotgan lizat tarkibidagi oqsillar birinchi navbatda gel elektroforezi bilan ajratiladi va jeldan g'ovakli membranaga o'tkaziladi. Keyinchalik, membrana maqsadli oqsilga xos antikorlar va birinchi antikorlar bilan bog'langan radioaktiv etiketli antikorlar bilan ketma-ket davolanadi. Ba'zida ikkinchi antikorlar o'rniga birinchi antikorlar bilan fermentativ reaktsiya amalga oshiriladi. Natijada, antikorlar tomonidan tan olingan maqsadli oqsil molekulalari avtoradiogrammadagi chiziqlar yoki membranadagi dog'lar sifatida aniqlanadi, ular orqali oqsilni aniqlash mumkin [18][19].

Mass-spektrometriya

Asosiy maqola: Mass-spektrometriya
Mass-spektrometriya o'rganilayotgan birikmalarning molekulyar og'irligini aniqlashga qaratilgan bir qancha usullarni o'z ichiga oladi. U biologiyada, ayniqsa proteomikada keng qo'llanilishini topdi. Mass-spektrometriyadan foydalanganda, avvalo, namunadagi oqsillar ionlashtiriladi, so'ngra vakuum sharoitida ionlar saralanadi va aniqlanadi, chiqishda spektr beradi, keyinchalik maxsus hisoblash usullari bilan tahlil qilinadi. Oxir-oqibat, har bir ion uchun massaning zaryadga nisbati qiymati aniqlanadi. Agar ionning zaryadi bir ga teng bo'lsa, u holda nisbat son jihatdan uning molekulyar og'irligiga teng bo'ladi. Dastlab biologiyada mass-spektrometriyadan foydalanish cheklangan edi, chunki ionlanish juda qattiq bo'lib, molekulalarning nobud bo'lishiga olib keldi. 1980-yillarda molekulalarni nurga sezgir organik moddalar bilan birgalikda kristallanish jarayonida lazer yordamida ionlash usuli ishlab chiqilgan (u matritsa deb ataladi). Matritsa tekshirilayotgan moddaning molekulalarini o'rab oladi va lazer ta'sirida qo'shni molekulalarni ionlashtiradi. Muayyan sharoitlarda ionlash o'rganilayotgan molekulalarni yo'q qilmasdan amalga oshirilishi mumkin. Bu usul matritsa yordamida lazer desorbsion ionlash (MALDI) deb ataladi. Yangi ionlash usuli an'anaviy massa spektrometrik detektori (parvoz vaqti, TOF) bilan birlashtirildi. Ushbu detektorda ionlar vakuum trubkasida harakatlanadi va detektor bo'lgan sezgir plastinkaga (fotoko'paytiruvchi naycha) etib boradi. Ionning kolba uzunligi bo'ylab harakatlanishi uchun ketadigan vaqt uning massasiga teskari proportsionaldir. 1990-yillarda va 2000-yillarning boshlarida MALDI-TOF usuli oqsil tadqiqotlari uchun juda faol ishlatilgan.


Izotopik ajralishning o'ziga xos xususiyatlari tufayli katta oqsillarning spektrlaridagi cho'qqilarni tahlil qilish juda qiyin. Shu sababli, ular tahlil qilishdan oldin tripsin fermenti yordamida 500-2500 Da peptidlarga bo'linadi, so'ngra peptidlar uchun ma'lumotlardan asl oqsil haqidagi ma'lumotlar tiklanadi, xuddi yangi avlod nuklein kislotalari, dastlabki ketma-ketliklar ketma-ketligi kabi. qisqa o'qishlardan to'plangan[uz]. Ushbu yondashuv pastdan yuqoriga proteomika deb ataladi. Yig'ish jarayoni xatosiz emas va katta ma'lumot yo'qotilishiga olib keladi, shuning uchun ba'zi hollarda butun oqsillar kuchli ultra yuqori aniqlikdagi detektorlar ("top-down proteomics [en]", inglizcha yuqoridan pastga) yordamida parchalanmasdan tekshiriladi. ) [22].

Proteinni tripsin bilan davolash natijasida olingan peptidlarning molekulyar og'irliklari to'plami har bir oqsil uchun o'ziga xosdir. Bu asosan tripsinning yuqori o'ziga xosligi bilan bog'liq bo'lib, u faqat lizin va arginin qoldiqlarini kesib tashlaydi. O'rganilayotgan oqsil uchun peptidlarning molekulyar massalarining olingan rasmini ma'lumotlar bazalaridagi oqsillarning peptid xaritalari bilan taqqoslab, qaysi oqsil o'rganilganligini aniqlash mumkin. Ushbu yondashuv peptid barmoq izlari deb ataladi [23]. Peptidlarning eksperimental massa taqsimoti va mos yozuvlar peptid xaritalari o'rtasida to'liq mos kelishiga erishish mumkin emasligi sababli, eksperimental peptid xaritasining ushbu nazariyaga mos kelishi ehtimolini miqdoriy baholash (ing. ball) kiritildi. Peptid barmoq izlari uchun maxsus dasturlar ishlab chiqilgan, masalan, MOWSE

Protein-oqsil o'zaro ta'siri
Asosiy maqola: Protein-oqsil o'zaro ta'siri
Protein-oqsil o'zaro ta'sirini o'rganishning eng mashhur usullaridan biri xamirturushli ikki gibrid tizimdan foydalanishdir. Shu maqsadda haploid xamirturushning ikkita shtammi olinadi, ulardan biri o'rganilayotgan oqsil (o'lja), ikkinchisi esa birinchi (o'lja) bilan o'zaro ta'sir qilish uchun tekshirilishi kerak bo'lgan oqsildir. Keyin haploid hujayralar ikkala oqsilni ifodalovchi diploid xamirturush hujayralarini hosil qilish uchun birlashtiriladi. Agar oqsillar o'zaro ta'sir qilsa, ularning ikkalasi ham transkripsiya faktorini hosil qiladi, bu esa reportyor genining ifodasini qo'zg'atadi. Agar oqsillar o'rtasida o'zaro ta'sir bo'lmasa, u holda reportyor genning ifodasi boshlanmaydi. S. cerevisiae xamirturushida ushbu yondashuvdan foydalanib, 6000 ta yirtqich klonni 6000 oʻlja kloniga qarshi skrining yordamida 691 ta oqsil-oqsil oʻzaro taʼsirini aniqlash mumkin boʻlgan, ulardan faqat 88 tasi ilgari maʼlum boʻlgan [29]. 21-asrda oqsil-oqsil o'zaro ta'sirini o'rganish uchun plazmon rezonansi[30][31] kabi boshqa usullar qo'llaniladi.

Protein-oqsilning o'zaro ta'siri to'g'risidagi ma'lumotlarga asoslanib, ba'zi hollarda oqsilning funktsiyalari haqida xulosa chiqarish mumkin. Misol uchun, agar oqsil bir xil metabolik yo'lda bir nechta oqsillar bilan o'zaro ta'sir qilishi ma'lum bo'lsa, unda u ham ishtirok etadi. Proteinlarning o'zaro ta'siri xaritalari interakt deb ataladi. Protein o'zaro ta'siri haqidagi ma'lumotlarni saqlaydigan ma'lumotlar bazalari mavjud[32].

Protein-oqsil o'zaro ta'siri to'g'risidagi ma'lumotlar biologik tarmoqlar va tizimlar biologiyasi uchun juda muhimdir: ular, masalan, signal kaskadlarini qayta qurishda qo'llaniladi [33][34].

Protein mikromassivlari

Asosiy maqola: Protein mikromassivi
Namunadagi o'ziga xos oqsillarni aniqlash uchun oqsil mikromassivlari ishlab chiqilmoqda. DNK mikroarraylariga o'xshab, qattiq substratga antikorlarni o'z ichiga olgan juda kichik tomchilar qo'llaniladi. Har bir tomchi mikrosxemalar bilan yorliqlangan namuna sifatida chipga qo'shiladigan bitta maxsus oqsilga antikorlarni o'z ichiga oladi. Yuvishdan so'ng, floresan faqat antikorlar o'rganilayotgan oqsilni bog'lagan tomchilarda aniqlanadi. Antikorlar o'rniga oligonükleotidlar kabi o'ziga xos oqsillar bilan maxsus ta'sir o'tkazadigan boshqa molekulalardan foydalanish mumkin [35]. Protein-oqsil o'zaro ta'sirini aniqlash va oqsil funktsiyalarini aniqlash uchun oqsil mikromassivlaridan ham foydalanish mumkin. 2000-yillarda oqsil mikromassivlari avtomatlashtirildi. Ular juda sezgir va sinovdan o'tish uchun juda kam protein talab qiladi, bu ularni iqtisodiy jihatdan samarali qiladi [36].

Proteomikada bioinformatika

Mass-spektrometriya va chiplardan foydalanib, siz oqsil bo'laklari haqida ma'lumot olishingiz mumkin, ammo butun protein haqida emas. Shu munosabat bilan, mass-spektrometriya va chiplarning parcha-parcha ma'lumotlari asosida ushbu bo'laklardan deyarli to'liq yig'ilgan oqsillar to'g'risidagi ma'lumotlarni taqdim etadigan dasturlar yaratildi. Bu dasturlar UniProt[37] va PROSITE[en][38] maʼlumotlar bazalaridagi maʼlum oqsillar bilan fragmentlarni moslashtirishga asoslangan.

Proteinlarni tahlil qiluvchi dasturlarning aksariyati ularning translatsiyadan keyingi modifikatsiyalarini hisobga olmaydi [39]. Post-tarjimaviy o'zgarishlarni aniqlaydigan mavjud vositalar faqat bashoratlidir[40].

Biomarker oqsillarini o'rganish uchun bioinformatikaning hisoblash usullari faol qo'llaniladi. Shunday qilib, kompyuter modellari yordamida homiladorlik davrida onaning tanasi va homila o'rtasida intensiv oqsil almashinuvini ko'rsatish mumkin bo'ldi va tahlil qilish uchun onadan faqat invaziv bo'lmagan qon namunalarini olish kerak edi [41].

Genomik ketma-ketliklardan olingan ma'lumotlarni tasdiqlash uchun proteomika usullaridan foydalanadigan proteogenomika rivojlanmoqda [42][43]. Bundan tashqari, rentgen nurlari difraksion tahlili va NMR spektroskopiyasiga asoslangan oqsil tuzilmalarini keng ko'lamli o'rganish bilan shug'ullanadigan strukturaviy proteomika ham mavjud [44].

Proteomika va tizim biologiyasi
Miqdoriy proteomikaning so'nggi yutuqlari uni uyali tizimlarni chuqur tahlil qilish uchun ishlatishga imkon beradi[33][34]. Biologik tizimlarning turli ta'sirlarga (tashqi omillarning ta'siri, hujayra siklining turli fazalari tufayli hujayra fiziologiyasining o'zgarishi va boshqalar) javoban oqsil tarkibidagi o'zgarishlar darajasidagi xatti-harakatlarini tavsiflash uni chuqurroq tushunishga imkon beradi. ko'pgina biologik jarayonlarning mohiyati. Shu sababli proteomika genomika, transkriptomika, epigenomika, metabolomika va boshqa "-omika" [en] bilan birga yangi ilmiy yo'nalish - tizimli biologiyaga kiritilgan. Shunday qilib, The Cancer Proteome Atlas 4000 dan ortiq tahlil qilingan o'simta namunalarida 200 ga yaqin oqsillarni ifodalash bo'yicha miqdoriy ma'lumotlarni o'z ichiga oladi, bu oqsillar uchun genomik va transkriptom ma'lumotlarini o'z ichiga olgan Saraton Genomi Atlasini to'ldiradi[45].

Amaliy foydalanish

MALDI-TOF yordamida patogen mikroorganizmlarni nasl va turlarning aniqligi bilan aniqlash mumkin. Buzilmagan bakteriya hujayralari massa spektrometrining metall nishoniga qo'llaniladi, matritsa bilan qoplangan, nurlangan.