Kurs ishi mavzu: Proteomika fani va uning istiqbollari. Bajardi: Sobirova Sadoqat Qabul qildi : Babajanov Ilyor Tojibayevich Urganch 2022

O‘ZBEKISTON RESPUBLIKASI OLIY VA O’RTA MAXSUS
TA’LIM VAZIRLIGI URGANCH DAVLAT
UNIVERSITETI



Tabiiy fanlar fakulteti biologiya yo’nalishi
192-guruh talabasi Ozadova Shahzodaning
Genetika va genomika fanidan

KURS ISHI

Mavzu:Proteomika fani va uning istiqbollari .


Bajardi: Sobirova Sadoqat


Qabul qildi : Babajanov Ilyor Tojibayevich


Urganch 2022
MUNDAREJA

	Kirish
	Adabiyotlar sharhi
	Proteomika fani haqida tushuncha
	Proteomika fanining tarixi va ahamiyati
	Proteomika fanining usullari va vazifalari
	Proteomika fanining asoslari
	Proteomika fanining rivojlanishida bioinfarmatikaning o`rni
	Proteomika fanining asoslari : oqsil va peptidlarning kimyoviy tuzulishi
	Proteomika va genomika fanlari o`rtasidagi farq
	Xulosa
	Foydalaniligan adabiyotlar

Kirish
Mavzuning dolzarbligi :

Proteomika - molekulyar biologiyaning oqsillarni aniqlash va miqdorini aniqlashga bag'ishlangan sohasi (boshqacha qilib aytganda, yuqori samarali protein tadqiqoti). "Proteomika" atamasi 1997 yilda taklif qilingan [1]. Hujayradagi barcha oqsillarning yig'indisi proteoma deb ataladi [2].

Proteomikaning o'rganish ob'ekti ma'lum bir hujayra, to'qima yoki organizmda ma'lum bir vaqtning o'zida (ya'ni proteoma) ifodalangan oqsillardir. Proteomikaning birinchi usullari, masalan, Edman oqsillarini sekvensiyasi genomik texnologiyalardan ancha oldin paydo bo'lgan bo'lsa-da, oqsillarni haqiqatan ham yuqori o'tkazuvchanlik bilan o'rganish faqat genomikdan keyingi davrda, ya'ni genomlarning ma'lum nukleotid ketma-ketligi mavjudligida mumkin bo'ldi. turli organizmlar.

Vazifalar va ma'no
Genomika va transkriptomikadan keyin proteomika biologik tizimlarni o'rganishning navbatdagi bosqichidir. Proteomikaning asosiy vazifasi yangi oqsillarni aniqlash va ularning miqdoriy tahlilidir. Shunga ko'ra, proteomika ob'ektiv ravishda genomikaga qaraganda murakkabroq, chunki organizmning genomi ko'p hollarda hayot davomida o'zgarmaydi, lekin uning barcha oqsillari yig'indisi doimiy ravishda o'zgarib turadi. Hatto bir xil organizmning har xil turdagi hujayralarining proteomalari ham farqlanadi. Bundan tashqari, proteomani o'rganish boshqa holatlar bilan ham murakkablashadi, masalan, ko'plab oqsillar duchor bo'lgan translatsiyadan keyingi modifikatsiyalar (tarjimadan keyingi modifikatsiyalar proteomikaning bo'limlarida o'rganiladi - fosfoproteomika[en] va glikoproteomika[en]). Ko'pgina oqsillarning faolligi uchun boshqa oqsillar va RNK bilan o'zaro ta'sir muhim ahamiyatga ega, bu ham ularni aniqlashni qiyinlashtiradi. Va nihoyat, ba'zi oqsillar shunchalik qisqa umr ko'radi va shunchalik tez parchalanadiki, ularni mavjud usullar bilan tuzatish juda qiyin [3].

Proteomika usuli bilan olingan ma'lumotlar turli kasalliklarning, masalan, neyrodegenerativ kasalliklarning sabablarini chuqurroq tushunishni shakllantirish, shuningdek, davolash usullarini ishlab chiqish uchun ishlatilishi mumkin. Proteomika yangi vaktsinalarni yaratish uchun mos keladigan antijenlarni qidirish uchun ishlatiladi. Turli xil saratonlarda g'ayritabiiy tarzda ifodalangan oqsillarni aniqlash biomarkerlarga asoslangan saraton tashxisi, prognozi va davolash uchun katta ahamiyatga ega [4].

Usullari
Proteinlarni o'rganishga an'anaviy yondashuv ularni to'qimalar va hujayralardan ajratib olishni, so'ngra tozalashni o'z ichiga oladi, buning natijasida tozalangan oqsilning tuzilishi va funktsiyalarini tahlil qilish mumkin bo'ladi. Proteomika boshqa yondashuvni qo'llaydi: hujayradagi protein tarkibini bir bosqichda ko'rish va tahlil qilish mumkin. Bu mass-spektrometriya va ikki o'lchovli elektroforez kabi usullar va texnologiyalarning paydo bo'lishi va rivojlanishi tufayli mumkin bo'ldi. Biroq, proteomika usullari bu ikki misol bilan cheklanmaydi [2]. Quyida oqsillarni o'rganish uchun hozirda qo'llaniladigan usullar, shu jumladan, hozirgi bosqichda kamdan-kam qo'llaniladigan oqsil aminokislotalari ketma-ketligini miqdoriy tahlil qilish va ketma-ketlashtirish usullari keltirilgan.

Protein tuzilmalari haqida ma'lumot talab qilmaydigan miqdoriy tahlil

Enzimatik faollikka ega oqsillarni miqdoriy tahlili bilvosita ushbu oqsillarning faolligini[en] aniqlash orqali amalga oshirilishi mumkin. 20-asrning boshlarida ham bunday tahlilni spektrofotometrik usullar yordamida amalga oshirish mumkin edi. Katalizator miqdori shartli faoliyat birliklarida baholanadi. Alanin aminotransferaza va aspartat aminotransferaza kabi biomarkerlarning qon kontsentratsiyasini tavsiflash uchun shartli faoliyat birliklari hali ham qo'llaniladi. 1975 yilda monoklonal antikorlarni ishlab chiqarish usuli ishlab chiqildi va ular tezda protein tadqiqotida foydalanishni topdilar. Misol uchun, agar berilgan antikorning antigeni ma'lum bo'lsa, u holda bu antikor yordamida eksperimental namunada o'rganilayotgan antigenni aniqlash mumkin. Tibbiyotda antikorlar 21-asrda biomarkerlar sifatida keng qo'llaniladi, ularning antijeni noma'lum, ammo ular kasal odamlarda sog'lom odamlarga qaraganda ko'proq antigenni bog'laydi. Masalan, CA-125 glikoprotein tuxumdon saratoni uchun biomarker sifatida 1981 yildan, unga antikorlar olingandan beri foydalanilgan. Keyinchalik, oqsilning o'zi, musin 16 aniqlandi [5].

Proteinlar ketma-ketligi

Asosiy maqola: Edman usuli
1953 yilda Frederik Sanger insulin gormonining aminokislotalar ketma-ketligini aniqladi. Sanger N-terminal qoldiqlarini yorliqlash va identifikatsiyalash uchun 1-ftor-2,4-dinitrobenzol[en] dan foydalanishni taklif qildi. Proteinning N-terminal qoldig'ini ushbu reaktiv bilan bog'lagandan so'ng, polipeptid zanjiri aminokislotalarni ajratish uchun xlorid kislota bilan gidrolizlanadi va etiketli qoldiq aniqlanadi. Agar oqsil bir nechta polipeptid zanjirlaridan iborat bo'lsa, u holda ikkala N-terminal qoldiqlari belgilanadi, ya'ni oqsildagi alohida polipeptid zanjirlari soni aniqlanadi. Butun oqsil ketma-ketligini ketma-ketlashtirish uchun Edman sekvensiyasi usuli ko'proq qo'llaniladi [6].

1950-yillarda shved kimyogari Per Edman oqsillarning aminokislotalar ketma-ketligini aniqlash usulini ixtiro qildi (ketma-ketlik). Edman sekvensiyasining birinchi bosqichi o'rganilgan peptidni fenil izotiosiyanat bilan davolash bo'lib, u aminokislotalar bilan o'zaro ta'sir qiladi va feniltiokarbomoil radikalini beradi. Eritmaning o'rtacha kislotalanishi bilan u N-terminal aminokislotasini olib, parchalanadi. Natijada, bu aminokislota uchun o'ziga xos radikal bo'lgan tiazolinon eritma ichiga kiradi. Ushbu lotin xromatografik tahlil qilinadi, qaysi aminokislota N-terminusda bo'lganligini aniqlaydi va tsikl takrorlanadi. Agar o'rganilayotgan oqsil qattiq tayanchga mahkamlangan bo'lsa, u holda fenil izotiosiyanat bilan har bir davolashdan so'ng uni yuvish, N-terminal tiazolinonni olib tashlash va yangi tsiklni boshlash mumkin. Edman usuli 30 tagacha aminokislota qoldiqlari ketma-ketligini yuqori aniqlik bilan aniqlash imkonini beradi.

1960-yillarda Edman usulini amalga oshiruvchi avtomatik sekvenser yaratildi. Sangerga 10 yildan ko'proq vaqt sarflagan insulinning asosiy tuzilishini endi protein sekvenserida to'g'ridan-to'g'ri sekvensiyalash orqali bir necha kun ichida olish mumkin [7]. Edman usuli hozirda genomik ketma-ketligi noma'lum bo'lgan organizmlarni o'rganishda vaqti-vaqti bilan qo'llaniladi [8][9][10]. An'anaviy oqsil ketma-ketligi, shuningdek, ularning ko'pgina xususiyatlarini (masalan, translatsiyadan keyingi modifikatsiyalar) faqat genlar ketma-ketligidan tanib bo'lmaydigan hollarda ham qo'llaniladi [11].

Aksariyat oqsillarni ketma-ketlikdan oldin tartiblash uchun maxsus tayyorlash kerak. Birinchidan, disulfid bog'lari, agar mavjud bo'lsa, oqsilda oksidlanish yoki ditiotreitol bilan oksidlanish orqali buziladi. Keyinchalik, oqsil zanjiri proteazlar tomonidan bo'laklarga bo'linadi, chunki uzun oqsillarning ketma-ketligi past aniqlikka ega. Odatda, tripsin gidroliz uchun ishlatiladi, u faqat karbonil guruhi lizin yoki arginin qoldig'iga tegishli bo'lgan peptid aloqalariga ta'sir qiladi. Shuning uchun oqsil tarkibidagi lizin va arginin qoldiqlari soni to'liq gidroliz paytida aniqlansa, tripsin bilan ishlov berilgandan so'ng oqsil qancha bo'laklarga parchalanishini taxmin qilish mumkin. Olingan bo'laklar elektroforez (pastga qarang) yoki xromatografiya bilan qo'shimcha ravishda tozalanadi va Edmanga muvofiq ketma-ketlashtiriladi. Protein fragmentining ketma-ketligini bo'laklarga bo'lib qayta tiklash uchun u tripsin tomonidan tan olingan qoldiqlardan farqli qoldiqlarni taniydigan ferment tomonidan bo'laklarga bo'linadi. Olingan ikkita fragmentlar to'plamining bir-biriga mos kelishiga asoslanib, oqsilning to'liq aminokislotalar ketma-ketligi tiklanadi [12].

Disulfid bog'larining o'rnini aniqlash uchun oqsil yana tripsin bilan parchalanadi, lekin avval disulfid bog'larini buzmasdan. Olingan bo'laklar elektroforez bilan ajratiladi va tripsin bilan birinchi hazm paytida olingan bo'laklar to'plami bilan taqqoslanadi. Agar ikkita fragment o'rtasida disulfid bog'i mavjud bo'lsa, unda birinchi bo'laklar to'plamini ajratishda ular jelda ikkita chiziqqa o'xshaydi va ikkinchisining elektroforezi paytida ular bitta tasma hosil qiladi [13].

2D gel elektroforezi
Shuningdek qarang: Proteinlarning poliakrilamid gel elektroforezi Poliakrilamid geldagi oqsil elektroforezi - bu poliakrilamid geldagi oqsillar aralashmalarini ularning elektroforetik harakatchanligiga (polipeptid zanjirining uzunligi yoki molekulyar og'irligiga, shuningdek, oqsil molekulasining burmalanishiga bog'liq) ajratish usuli. tarjima modifikatsiyalari va boshqa omillar). Protein va peptidlarni fraksiyalashning bu usuli zamonaviy molekulyar biologiya, biokimyo va genetikada keng qo'llaniladi.

Turli xil muammolarni hal qilish va turli oqsillar va peptidlar uchun poliakrilamid geldagi oqsil elektroforezining ko'plab modifikatsiyalari ishlab chiqilgan. Eng keng tarqalgan o'zgarish - Laemmli (ing. SDS PAGE) bo'yicha natriy dodesil sulfat ishtirokida poliakrilamid jelda oqsil elektroforezi.

Ajratish mexanizmi
Jeldagi biopolimerlarning elektroforetik harakatchanligi bir qator parametrlarga bog'liq. Migratsiya tezligi molekula zaryadiga mutanosib bo'lib, erkin suyuqlikda bir xil o'ziga xos zaryadga ega bo'lgan molekulalar bir xil tezlikda ko'chib o'tadi. Qattiq fazoviy matritsaga ega bo'lgan muhitda ajralish holida, jelga nisbatan ishqalanish tufayli ajralish sodir bo'ladi. Ishqalanish kuchi molekulaning fazoviy konfiguratsiyasiga, shu jumladan uning hajmiga bog'liq. Shunday qilib, mahalliy oqsillarni elektroforetik ajralishda yuqoridagi omillarga qarab ularni taqsimlashning murakkab sxemasi kuzatiladi.

Laemmli tomonidan SDS-PAGE

1970 yilda Laemmli T4 bakteriofagining kapsidini yig'ish jarayonini o'rganish uchun molekulyar og'irligiga qarab poliakrilamid jelida oqsillarni elektroforetik ajratish usulini taklif qildi [1]. Buning uchun jelga qo'llashdan oldin namunalar natriy dodesil sulfat (SDS) va 2-merkaptoetanol ishtirokida qaynatiladi. 2-merkaptoetanol ta'sirida disulfid aloqalari tiklanadi, bu denatüratsiyalangan polipeptidlarning aylanadan chiqishiga va ularning harakatchanligini oshirishga to'sqinlik qiladi. SDS kuchli yuvish vositasi bo'lib, uning molekulasi o'n ikki a'zoli alifatik to'g'ri zanjir va unga kovalent bog'langan sulfatdan iborat bo'lib, eritmada manfiy zaryadga ega.

Ta'riflangan usuldan foydalanganda quyidagi taxminlar amalga oshiriladi:

SDS bilan davolashdan keyin oqsillar butunlay denatüratsiyalangan holatda;
polipeptid bilan bog'langan SDS molekulalarining soni uning uzunligi va shuning uchun molekulyar og'irligi bilan proportsionaldir;
polipeptidning o'z-o'zidan zaryadi u bilan bog'liq SDS zaryadiga nisbatan ahamiyatsiz.
Bunday sharoitda barcha polipeptidlar bir xil o'ziga xos zaryadga ega va ularning molekulyar og'irligi logarifmi bilan teskari ravishda ajralib turadi. Amaliyot aksariyat hollarda ushbu taxminlarning to'g'riligini tasdiqlaydi.

PAAGda denaturatsiya qiluvchi elektroforezni o'tkazish uchun turli xil bufer tizimlari qo'llaniladi. Eng keng tarqalgan standart tizim Laemmli bufer tizimidir. Bundan tashqari, ishlarning katta qismi disk-elektroforez deb ataladigan (inglizcha uzluksiz - uzluksiz), ya'ni ikki qismdan iborat jeldan foydalanadi. Konsentratsiyali jel pH 6,8 va poliakrilamid konsentratsiyasi 2 dan 8% gacha. Ajratish jeli 8,5-9 mintaqada pH va poliakrilamid konsentratsiyasi 5 dan 20% gacha. Jel zichligini tanlash o'rganilayotgan oqsillarning molekulyar og'irligiga bog'liq. Barcha tamponlarda noorganik tuzlar mavjud emas, ulardagi asosiy oqim tashuvchisi glitsindir. PH 6,8 da glitsin molekulasining umumiy zaryadi nolga yaqin. Natijada, ma'lum bir zaryadni o'tkazish uchun (bu elektroforetik hujayradagi oqim kuchi bilan belgilanadi) SDS bilan polipeptidlarning manfiy zaryadlangan komplekslari yuqori tezlikda harakatlanishi kerak. PH 8,8 da glitsin manfiy zaryadga ega bo'ladi, buning natijasida oqsillar konsentratsiya qiluvchi va ajratuvchi jellar chegarasida keskin inhibe qilinadi (hozirda bir xil zaryadni birlik maydoni orqali uzatishda ko'proq zaryadlangan molekulalar ishtirok etadi, shuning uchun ular past tezlikda harakat qilishadi). Buning natijasi jellarning interfeysida oqsillarning kontsentratsiyasi bo'lib, bu usulning ruxsatini sezilarli darajada oshiradi.

Ajratish jelida oqsillar polipeptid zanjirining uzunligiga qarab, ya'ni molekulyar og'irligiga teskari proportsional ravishda ko'chiriladi.

Ajratish mahsulotlarini ingl

Elektroforez natijalarini tasavvur qilish uchun jellardagi oqsillarni Coomassie bo'yog'i yoki kumush bilan bo'yash ko'pincha qo'llaniladi. Western blotting uchun oqsillar jeldan nitroselüloza membranasiga o'tkaziladi.

Natijalarni talqin qilish

Ko'pgina hollarda, jelni vizual baholash orqali elektroforetik ajratish natijalarini olish kifoya. Biroq, ishonchli ma'lumotlarni olish va natijalarni to'g'ri hujjatlashtirish uchun jel juda sezgir densitometr yordamida uzatish orqali skanerlanadi. Darhaqiqat, densitometr - bu nazorat va o'lchash vositalariga tegishli bo'lgan va o'lchov vositasining xarakteristikalari belgilangan talablarga javob berishini aniqlash va tasdiqlash uchun tekshirilishi kerak bo'lgan skaner. Densitometrga qo'yiladigan bunday talablar nafaqat jeldagi oqsillarning holatini, balki oqsil nuqtasining optik zichligini ham ishonchli aniqlash imkonini beradi. Jelning raqamlashtirilgan tasviri maxsus dasturiy ta'minot yordamida qayta ishlanadi, bu sizga oqsilning elektroforetik harakatchanligi, uning tozaligi, nuqtadagi oqsil miqdori va boshqalar kabi parametrlarni ishonchli aniqlash imkonini beradi.

Oqsillarning molekulyar massasini aniqlash

O'rganilayotgan oqsilning molekulyar og'irligini aniqlash jelni molekulyar og'irliklar bo'yicha kalibrlash zarurligini talab qiladi. Jel sinov namunasi bilan parallel ravishda ajratilgan marker oqsillarining molekulyar og'irligiga nisbatan kalibrlanadi. Marker oqsillarning aralashmalari har xil vazn oralig'ida mavjud. Kalibrlash nisbiy elektroforetik harakatchanlikka (Rf) bog'liqlikni yaratishni o'z ichiga oladi.


1970-1980-yillarda oqsillarni ajratib olish va tozalash usullari rivojlandi. Bu usullar xromatografiya, elektroforez va sentrifugalash tamoyillarini birlashtirgan; ularning ko'plari uzoq vaqtdan beri foydalanilmay qolgan, ammo ba'zilari 21-asrda hamon foydalanilmoqda. 1970 yilda shveytsariyalik olim Ulrich Laemmli [en] denaturatsiya sharoitida elektroforez yordamida oqsillarni ajratish usulini taklif qildi. Birinchidan, oqsillar har bir oqsil molekulasini qatlam shaklida qoplagan natriy dodesil sulfat (SDS) ta'sirida qattiq denaturatsiyaga uchradi. Protein qanchalik katta bo'lsa, SDS unga shunchalik ko'p bog'lanadi va ularning kompleksi olingan salbiy zaryad shunchalik katta bo'ladi. Shuning uchun, namunalarni poliakrilamid jelga qo'llashda ular elektr maydoni ta'sirida harakat qila boshladilar; shu bilan birga, oqsil molekulalarining harakat tezligi ularning massasiga bog'liq (engilroq oqsillar jel orqali tezroq harakat qiladi). Usul massasi 5 dan 250 kDa gacha bo'lgan oqsillarni ajratish uchun juda mos keladi

Laemmli usuli yanada rivojlantirildi. 1975 yilda Patrik O'Farell va Yoaxim Kloze mustaqil ravishda ikki o'lchovli elektroforez deb ataladigan printsipni taklif qilishdi[uz]: SDS yordamida massa ajratishdan oldin oqsillar izoelektrik nuqtasiga ko'ra oldindan ajratiladi. Birinchidan, oqsillar maxsus polimerlar bilan to'ldirilgan shisha naychaga kiritiladi, ular unda qattiq pH gradientini yaratadilar. Proteinlar pH ularning izoelektrik nuqtasiga teng bo'lgan pozitsiyalarni egallab, naycha bo'ylab taqsimlanadi. Keyinchalik, naychaning tarkibi siqib chiqariladi va an'anaviy Laemmli elektroforezi uchun jelga biriktiriladi. Shunday qilib, oqsillar birinchi navbatda izoelektrik nuqtaga, keyin esa massaga bo'linadi. Ikki o'lchovli elektroforez natijasida har bir oqsil an'anaviy elektroforezda bo'lgani kabi bandga emas, balki o'lchami va rangi intensivligi oqsil kontsentratsiyasiga mos keladigan fokuslangan yumaloq nuqtaga mos keladi. Ikki o'lchovli elektroforezdan foydalanib, nafaqat turli xil oqsillarni, balki bir xil oqsilning izoformlarini, shuningdek, turli post-translatsion modifikatsiyaga ega bo'lgan oqsil shakllarini ajratish mumkin. 2D elektroforez texnikasini turli xil takomillashtirish taklif qilindi, uning ba'zi bosqichlari, shuningdek, skanerlangan jellarni qayta ishlash avtomatlashtirildi. Aslida, ikki o'lchovli elektroforez proteomani tasavvur qilishning yagona usuli hisoblanadi