TAL effektori DNKni bog ’laydigan domen TAL effektlari - bu Xanthomonas bakteriyalari tomonidan sintezlanadign oqsillar. DNKni bog’laydigan domen 12 va 13-aminokislotalarning ajralib turadigan yuqori konservativ 33-34 aminokislotalar ketma-ketligini o’z ichiga oladi. Takrorlanuvchi o’zgaruvchan diresid (RVD) deb nomlangan ushbu ikki pozitsiya juda o’zgaruvchan va o’ziga xos nukleotid tan olinishi bilan kuchli korrelyatsiyani ko’rsatadi. Aminokislotalar ketma-ketligi va DNKni tanib olish o’rtasidagi o’zaro bog’liqlik tegishli RVDlarni o’z ichiga olgan takroriy segmentlarning kombinatsiyasini tanlash orqali ma’lum DNKni bog’laydigan domenlarni loyihalashga imkon berdi.
DNKni ajratish domeni
FokI endonuklezatsiyasining oxiridan boshlab spetsifik bo’lmagan DNK ajratish domeni ko’plab turli xil hujayralar turlarida faol bo’lgan gibrid nuklazlarni qurish uchun ishlatilishi mumkin. FokI domeni noaniq vazifani bajaradi, maqsadli genomdagi saytlar uchun to’g’ri yo’nalish va masofaga ega bo’lgan noyob DNK bilan bog’lanadigan domenlarga ega ikkita konstruktsiyani talab qiladi. TALE DNKni bog’laydigan domen va FokI ajratish domeni orasidagi aminokislotalar qoldiqlari soni va ikkala individual TALEN ulash joylari orasidagi bazalar soni yuqori darajadagi faollikka erishish uchun muhim parametrlar bo’lib ko’rinadi.
TALEN mexanizmi aminokislotalar ketma-ketligi va TALE ni bog’lash sohasini DNKni aniqlash o’rtasidagi sodda bog’liqlik oqsillarni samarali ravishda ishlab chiqishga imkon beradi. TALEN konstruktsiyalari yig’ilgandan so’ng ular plazmidlarga joylashtiriladi; maqsad hujayralar keyin plazmidlar bilan transfektsiyalanadi va gen mahsulotlari ifoda etiladi va genomga kirish uchun yadroga kiradi. Shu bilan bir qatorda, TALEN konstruktsiyalari hujayralarga mRNA kabi etkazilishi mumkin, bu TALEN ifoda etadigan oqsilning genomik integratsiyasi imkoniyatini yo’q qiladi. MRNA vektoridan foydalanish, shuningdek, homologiyaga yo’naltirilgan ta’mirlash (HDR) darajasini va genlarni tahrirlash jarayonida introgresiyaning muvaffaqiyatini sezilarli darajada oshirishi mumkin.
TALEN texnologiyasidan hujayralar tuzatish mexanizmlari bilan javob beradigan ikki qatorli tanaffuslarni (DSB) qo’zg’atish orqali genlarni tahrirlash uchun foydalanish mumkin. Nomologik bo’lmagan qo’shilish (NHEJ) DNKni ikki tomonlama tanaffusning ikkala tomonidan bog’lanadi, bu erda yumshatish uchun ketma-ketlik juda kam yoki umuman bo’lmaydi. Ushbu tuzatish mexanizmi kiritish yoki o’chirish yoki xromosomani qayta o’zgartirish orqali genomdagi xatolarga olib keladi; har qanday bunday xatolar gen mahsulotlarini kodlangan joyda ishlashga olib kelishi mumkin. Ushbu faoliyat turlarga, hujayra turiga, ishlatiladigan genga va ishlatilgan nuklazaga qarab farq qilishi mumkinligi sababli, yangi tizimlarni loyihalashda uni nazorat qilish kerak. Shu bilan bir qatorda, DNK genogenga NHEJ orqali ekzogen ikki qatorli DNK qismlari mavjudligida kiritilishi mumkin.
Gen terapiyasini qo’llash Masalan, TALEN texnologiyasi barqaror ravishda o’zgartirilgan insonning embrional ildiz hujayrasini va induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari (IPSCs) va insonning eritrotsitlari liniyalarini samarali ravishda loyihalash uchun ishlatilgan. Ushbu texnologiya, shuningdek, kasallik asosidagi genetik xatolarni tuzatish uchun eksperimental ravishda ishlatilgan. Misol uchun, u in vitro dan o’roq hujayra kasalligi, kseroderma pigmentosum va epidermoliz bulosa kabi kasalliklarni keltirib chiqaradigan irsiy nuqsonlarni tuzatish uchun ishlatilgan. Shuningdek, TALEN texnologiyasidan saraton kasalligiga qarshi kurashish uchun immunitet tizimidan foydalanish vositasi sifatida foydalanish mumkinligi ko’rsatildi. Nazariy jihatdan, ishlab chiqilgan TALEN termoyadroviylarining genom-o’ziga xos xususiyati individual genetik joylardagi xatolami to’g’ri ekzogen shablondan homologik yo’naltirilgan tuzatish orqali tuzatishga imkon beradi. Aslida esa, vaziyatda TALEN® texnologiyasini qo’llash samarali etkazib berish mexanizmining yo’qligi, noma’lum immunogen omillar va TALEN ulanishining o’ziga xos xususiyati bilan cheklangan. TALEN® texnologiyasining yana bir paydo bo’ladigan usuli bu boshqa genom muhandislik vositalari, masalan meganukleazlar bilan birlasha olish qobiliyatidir. TAL effektorining DNK bog’laydigan hududi meganuklezaning yorilish sohasi bilan birlashtirilishi mumkin, bu TAL effektining muhandislik qulayligi va yuqori spektrli DNK bilan bog’lanish faolligini birlashtirgan giper arxitekturani yaratish uchun past darajadagi chastota va meganuklezning o’ziga xos xususiyati bilan. masalan, meganuklazlar. TAL effektorining DNK bog’laydigan hududi meganuklezaning yorilish sohasi bilan birlashtirilishi mumkin, bu TAL effektining muhandislik qulayligi va yuqori spektrli DNK bilan bog’lanish faolligini birlashtirgan giper arxitekturani yaratish uchun past darajadagi chastota va meganuklezning o’ziga xos xususiyati bilan. masalan, meganuklazlar. TAL effektorining DNK bog’laydigan hududi meganuklezaning yorilish sohasi bilan birlashtirilishi mumkin, bu TAL effektining muhandislik qulayligi va yuqori spektrli DNK bilan bog’lanish faolligini birlashtirgan giper arxitekturani yaratish uchun past darajadagi chastota va meganuklezning o’ziga xos xususiyati bilan.
2015 yilda Buyuk Ormond Street kasalxonasining shifokorlari TALEN asosidagi genom tahrirlashning birinchi klinik qo’llanilishini e’lon qilishdi. CD19 + o’tkir limfoblastik leykemiya bilan kasallangan 11 oylik chaqaloq, leykemiya hujayralariga hujum qilish, Alemtuzumabga qarshi turish va kiritilgandan so’ng, asosiy immunitet tizimining aniqlashdan qochish uchun ishlab chiqilgan donor T hujayralari bilan davolandi. Terapiyadan bir necha hafta o’tgach, bemorning ahvoli yaxshilandi; shifokorlar ehtiyotkor bo’lishiga qaramay, davolanishdan keyin bemor bir necha oy davomida remissiyada.
