Kirish I bob. Genlar genomdagi lokalizatsiyasi va uning tarifi

o’rganish metodlari.
2.1. Eukariotlar genomlarini o’rganish metodlari.
Eukaryotlarning genomlari noyob va takrorlanuvchi nukleotidlar ketma-ketligidan iborat. Parchalangan DNK reassociatsiyasi kinetikasi asosida aniqlangan genomdagi noyob ketma-ketliklar tarkibi har xil organizmlar orasida farq qiladi va ular nisbati barcha DNKning 15–98% ni tashkil qiladi. Ko'p tarkibiy genlar noyob ketma-ketliklar fraktsiyasiga tushishiga qaramay, noyob ketma-ketliklarning aksariyati kodlanmaydi va odatda ushbu atamaning qabul qilingan ma'nosida genetik ma'lumotlarni o'z ichiga olmaydi: ular funktsional jihatdan muhim polipeptid zanjirlari yoki RNKlarni kodlamaydilar. Bunday noyob ketma-ketlikning ma’lum i namunasi - bu intronlardir, ularning umumiy hajmi kattaliklar tartibiga ega yoki ularni o'z ichiga olgan genlarning tashqi hujayralarining umumiy hajmidan kattaroqdir. Evukarotik genlarning mozaik (intron - ekzon) tuzilishining evolyutsion paydo bo'lishi, shuningdek, genlardagi intronlarning o'lchamlari va nisbiy pozitsiyalari merosning konservativ tabiati aniq biologik funktsiyalarga ega bo'lmagan holda nuklotidlar ketma-ketligida tabiiy tanlanish bosim omilining mavjud emasligi sababli to'liq izoh topa olmaydi. . W. Gilbert (1977) tushunchasiga ko'ra, hujayralar paydo bo'lishi, vaqt o'tishi bilan ko'p hujayrali organizmlarning evolyutsion paydo bo'lishi bilan bir vaqtning o'zida bir-biriga bog'liq bo'lmagan genlar orasida ekzon almashinuvini ta'minlagan holda keng qo'llanilgan. Bunday almashinuv ilgari boshqa oqsillarga tegishli bo'lgan tayyor polipeptidning funktsional ahamiyatli modullaridan (domenlaridan) iborat yangi mozaik tuzilishdagi oqsillarni shakllantirish bilan birga bo'lishi kerak. Ushbu kontseptsiya tarafdorlarining fikriga ko'ra, yangi funktsiyalarga ega bo'lgan oqsillar va fermentlarning shakllanishini keskin tezlashishi, shuningdek, bunday molekulyar mexanizmlarni amalga oshiradigan organizmlarning chuqur evolyutsion o'zgarishlaridir. Ushbu ko'rinish "intronlarning kech kelib chiqishi gipotezasi" deb nomlanadi. Boshqa bir J.E. Darnella va V.F. Dulitle (1978) gipotezasiga muvofiq, xozirgi intronalar "evolyutsion izohlar" dir. Intronlar bir vaqtlar yirik genlarning bir qismi bo'lgan. Evolyutsion nuqtai nazardan sir emaski, ko'p hujayrali organizmlarning genomida ko'p kodlanmagan takrorlanadigan ketma-ketlikning paydo bo'lishi. Bunday takrorlashlar bir nechta nusxada eukaryotlarning gaploid genomida namoyon bo'ladi. Takrorlashning zamonaviy tasnifida tez-tez takrorlanadigan ketma-ketliklarni ajratish odat tusiga kiradi, ularning soni har bir gaploid genomiga 105 tadan oshadi va o'rtacha takrorlanadigan, 10-104 nusxada berilgan. Birinchisining puxta o'rganilgan vakili bu sun'iy satellit DNK bo'lib, u uzun tandemdan uzun bloklarda tashkil qilingan uzunligi 1–2 bp ni tashkil qiladi. Eukaryotlarning takrorlanadigan DNK ketma-ketliklaridan birinchilardan biri sun'iy satellit buzoq timusining DNKini kashf qildi. Ular o'zlarining ismlarini umumiy eukaryotik DNKni tsesium xloridning zichlik gradientida sentrifugalash orqali tahlil qilganda, yelkama-yelka (satellit) ko'rinishidagi optik zichlikning eng yuqori cho'qqisiga chiqdilar. Bu sun'iy yo'ldosh DNK fraktsiyasining bir hil nukleotid tarkibi bo'lib, unda ko'p sonli qisqa takrorlanishlar mavjudligi aniqlandi, bu sentrifugatsiya yordamida aniqlanadigan suzuvchi zichligini o'zgartirdi. Sun'iy satellit DNKning klassik ta'rifida Britten va boshq. (1974), sun'iy satellitlar CsCl zichlik gradyanida muvozanat ultratsentrifugatsiyasida asosiy DNKdan ajraladigan DNKning ahamiyatsiz tarkibiy qismi ekanligini ta'kidladi. Satellitlar bir qator xususiyatlar bilan ajralib turadi, ular orasida eng muhimi quyidagilar: a) DNKning qayta tiklanish jarayonida tezkor va aniq reassosatsiya; b) ko'p nusxalar; c) oddiy boshlang'ich struktura; d) bir hil kompozitsion (bir xil takrorlanadigan bloklarning kengaytirilgan klasterlari ketma-ket); e) purin - DNK zanjirlari bo'ylab nukleotidlarning tarqalishidagi pirimidin assimetriyasi; e) peritsentromerik geteroxromatin tarkibidagi konsentratsiya; g) xromosomalarning polifenizatsiyasi paytida cheklangan replikatsiya (replikatsiya ostida); h) xromosomalarning tandem shaklida (birin-ketin) joylashgan klasterlar mavjudligi.[9]
Eukaryotik genomda sun'iy satellit DNK tarkibi DNK umumiy miqdorining 5-50% ni tashkil qilishi mumkin. Mikro (asosiy takroriy blokda 1 dan 4 bp gacha) va minisatellitli (individual takrorlashda bp ko'proq) DNK hatto bitta turga mansub bo'lgan organizmlarning genomlarida nusxalar sonining yuqori o'zgaruvchanligi bilan ajralib turadi va ba'zi hollarda irsiy beqarorlikka ega, ya’ni normal va organizmning ba'zi patologik sharoitlarida. Ushbu xususiyat tufayli mini va mikrosatellitlar ko'pincha o'zgaruvchan sonli tandemli VNTR (variable number of tandem repeats) deb nomlanadi. Takrorlashning yana bir turi bu katta bloklarga ajratilmagan, ammo genom bo'ylab tarqalib ketgan takrorlanadigan DNK ketma-ketligi. Ushbu turdagi takrorlashlar, teskari holda o'rtacha takrorlangan chastotalarni takrorlash (MER) deb nomlanadi,va ikkita keng sinfga bo'linadi: SINE (qisqa interspersed elementlar) - qisqa va LINE (uzun interspersed elementlar) - uzun dispers elementlar. SINE elementlarining uzunligi 90-400 bp, LINE ketma-ketliklarining uzunligi esa 7 kb ga etadi. Odamlar genomidagi SINE sinfining sinchkovlik bilan o'rganilgan takrorlashlari va ba'zi primatlar - bu Alu takrorlashidir, uning takroriy birligi uzunligi ~ 300 bp. Alu takrorlanishlari inson genomida ~ 106 nusxada taqdim etiladi va o'rtacha har 4 Kbda sodir bo'ladi, bu DNK umumiy miqdorining ~ 5% ni tashkil qiladi. Strukturaviy o'xshash takrorlanadigan B1 deb nomlangan sichqonlar genomida topilgan va ko'plab sut emizuvchilarda boshqa nomlar bilan tasvirlangan. Garchi LINE ketma-ketliklarida retrotransposonlarning belgisi bo'lgan teskari transkriptaza genlari mavjud bo'lsa (retrovirus genomiga strukturaviy o'xshashlik bilan hayvonlarning ko'chma genetik elementlari), ammo ular ketma-ketlikning yo'qligi bilan ajralib turadi,ya’ni retrotranspozonlarga xos bo'lgan uzun terminal takrorlanadi (LTR). LINE ketma-ketligiga misol sifatida, hayvonlar genomida keng tarqalgan LINE-1 takrorlanishini eslatib o'tish mumkin. Sichqonlarning LINE-1 elementi ikkita ochiq o'qish maydonchasini o'z ichiga oladi, ORF-1 va ORF-2, ikkinchisi teskari transkriptazani o'tkazish uchun gomologik oqsilni kodlaydi. ORF-lar qisqa translyasiyalanmagan ketma-ketliklar va LINE-1 o'zlarini qisqa oldinga takrorlash (SDR) bilan ajratib turadi. 5-terminal takrorlash ketma-ketligi transkripsiya targ'ibotchisi sifatida ishlaydi. LINE-1 kemiruvchilarning bu qismi (lekin odamlar emas) monomerlar deb nomlangan A va F ikki xil takroriy qisqa tutamlardan qurilgan. Kalamushlarda monomerlarning uzunligi 600 bp ni tashkil qiladi Bundan tashqari, A- (lekin F emas) monomerlari promotorlarning faolligiga ega. Sun'iy yo'ldosh DNK singari SINE va LINE takrorlanishlari genetik beqarorlik bilan ajralib turadi. Ularning umumiy xususiyatlari transkripsiya va transpozitsiya qobiliyatidir. Mo'tadil takroriylardan olingan RNK ketma-ketliklari geterogen yadro RNKlarida uchraydi, bu erda ularning nisbati 20-30% ga etadi. Ikkala turdagi takrorlanuvchi elementlarning yangi nusxalari genomda retrotranspozitsiya yoki retropoziya deb nomlangan mexanizmning ishlashi natijasida paydo bo'lishi haqida tajriba dalillari mavjud. Bunday mexanizmning ishtirokida cDNA birinchi marta teskari transkriptaza ta'siri ostida tegishli takrorlanishning RNK transkript matritsasida hosil bo'ladi, keyinchalik retroviruslarda bo'lgani kabi genomning yangi lokusiga qo'shiladi. Bunday mexanizm eukarotik genomdagi ba'zi nukleotidlar ketma-ketliklarining nusxalarini mahalliy ravishda o'zgartirishga imkon beradi. Shunga qaramay, ko'pgina LINE ketma-ketliklari transpozitsiyani amalga oshirishga qodir emas va ularning ORFlari aniq psevdogenlarga - haqiqiy genlar ketma-ketligi uchun gomolog bo'lgan ifoda qilinmaydigan tartiblarga tayinlanishi mumkin.[8] Yuqorida aytib o'tilgan takrorlanuvchi ketma-ketliklar bilan bir qatorda, inson genomida 100000 dan ortiq LTR va retrovirus genomining minglab ketma-ketliklaridan iborat 2-3 MabR takroriy nusxalari mavjud. Eukaryotik genomda takroriy va noyob kodlanmagan ketma-ketliklar va ularning organizmlarning hayotiy sikli davomida yaqqol namoyon bo'lishiga qaramay, genomning ushbu va boshqa kodlanmagan elementlarining biologik ahamiyati aniq emas. Adabiyotda qizg'in muhokama qilingan ortiqcha genom DNKning "egoistligi" haqidagi gipoteza shubha tug'diradi, unga ko'ra barcha ortiqcha DNK genom parazit bo'lib, bir necha dastlabki ketma-ketliklarning aniq nusxalarini ko'chirish natijasida genomda tarqaladi. Darhaqiqat, DNK ajdodlari va DNKning biosintezi uchun energiya xarajatlari genomdagi "parazitar" DNK tarkibi genlarning nukleotidlari ketma-ketligini o'z ichiga olgan funktsional ahamiyatga ega DNK miqdoridan 2-3 kattaroq kattalikdagi hujayralardir. O'ziga xos DNK bilan "yuqtirgan" genom hujayralari, "parazit" bo'lmagan hujayralar bilan raqobatga bardosh berolmaydi, chunki genomning kamayishi uchun energiya xarajatlari sezilarli darajada oshadi. Bundan tashqari, egoistik DNK kontseptsiyasi, unga ko'ra "parazitar" nukleotidlar ketma-ketligi bo'yicha selektsiyaning evolyutsion bosimi mavjud emasligi, lokalizatsiya joylarining yuqori konservatizmini va filogenetik jihatdan yaqin bo'lgan organizmlarning gomologik genlaridagi intron miqdorini tushuntirib bermaydi, shuningdek takroriy nusxalar sonini qo'llab-quvvatlaydigan mexanizmni ko'rsatmaydi.[10]
Eukaryotik genom prokaryotlarga qaraganda ancha murakkab tuzilgan. Eukaryotik hujayraning genetik apparati hujayra yadrosi shaklida ajratilgan, uning ichida irsiyatning asosiy tashuvchilari xromosomalar joylashgan. Xromosomalar soni turlarga xos va ikkitadan (ot askaridasi) minggacha (tuban o'simliklar) o'zgaradi. Eukaryotik hujayralardagi DNK miqdori bakteriyalarga qaraganda ancha yuqori. C qiymati yordamida hisoblab chiqilgan – DNK gaploid soni miqdori, ya'ni genom bo'yicha turli xil turlarda 104 dan 1011 gacha o'zgarib turadi va ko'pincha turlarning tashkil etilish darajasi bilan bog'liq emas. Inson genomidagi DNK tarkibidan oshib ketgan C ning eng katta qiymatlari ba'zi baliqlar, dumli amfibiyalar va nilufarlarga xosdir.[3]
Eukaryotik genomda bitta nusxada faqat bir nechta gen mavjud. Ularning aksariyati turli xil nusxalarda taqdim etilgan. Yaqin bir xil genlar klasterlarni hosil qiladi. Klasterlarning mavjudligi genlarning rivojlanishida genlarning ko'payishi uchun muhim rol o'ynashini ko'rsatadi. Klaster namunasi: eritrotsitlar oqsillari genlari - globinlar. Gemoglobin - bu 4 polipeptid zanjiridan iborat bo'lgan tetramer: 2 va 2. Zanjirning har bir turi klasterda tashkil etilgan genlar bilan kodlangan. Odamlarda a-klaster 11-chi xromosoma, 16-xromosoma esa β-klaster joylashgan. K-klaster DNKning 50 ming b.p. hajmli qismini egallaydi besh funktsional faol gen va bitta psevdogenni o'z ichiga oladi. Psevdogenlar bir vaqtning o'zida faol genlardan mutatsion o'zgarishlar natijasida paydo bo'lgan, ishlamaydigan, relikt genlardir. Klasterdagi genlar bir-biridan speyser bilan ajratilgan - boshqaruvchi qismlar ba'zan bo'lishi mumkin bo'lgan transkripsiya qilinmagan qo'shimchalardir. Eukaryotik genlar va prokaryotik genlar o'rtasidagi asosiy farq shundaki, ularning ko'pchiligi uzluksiz tuzilishga ega va kodlash hududlaridan - ekzon va kodlanmagan qo'shimchalar - intronlardan iborat. Ekzonlarning uzunligi 100 dan 600 bp gacha, va intronalar bir necha o'nlabdan minglab bp gacha. Intronlar bir gen uzunligining 75% gacha bo'lishi mumkin. Genlarning uzluksiz tuzilishi ularning ishlashini yanada yaxshiroq nazorat qilish uchun asos yaratadi. Hosil bo'lmagan genlarni transkripsiya qilish natijasida birlamchi mahsulot - pro-mRNK hosil bo'ladi, bu genning to'liq nusxasi bo'lib, ekzon va intronga ham tegishli bo'limlarni o'z ichiga oladi. Transkripsiya jarayonida turli xil genlarni o'qiydigan uch xil RNK polimerazalari ishtirok etadi. RNAP-I turli xil rRNK shakllarining tuzilishini kodlovchi genlarni o'qiydi (5.8S, 18S, 28S). RNAP-II oqsillar va ba'zi snRNAlarning tuzilishini kodlovchi genlarni transkripsiya qiladi. Nihoyat, RNAP-III 5S rRNK, transport RNK va snRNA genlarini o'qiydi.[7]Turli xil miqdordagi protein transkripsiya omillaridan tashkil topgan protein kompleksi transkripsiya jarayonining boshlanishida ishtirok etadi. Sutemizuvchilarda uning umumiy massasi 600 kDa bo'lgan 12-14 polipeptidlar mavjud. Transkripsiyaning intensivligini tartibga solishda maxsus boshqaruvchi qismlar, enxanserlar va saylenserlar ishtirok etadi. Birinchisi kuchaytirildi, ikkinchisi transkripsiya jarayonini susaytiradi. Ular minglab bp tomonidan promoterdan olib tashlanishi mumkin. Ularning nazorati ostida tartibga soluvchi oqsillar sintez qilinadi. Transkripsiya jarayonida DNKdagi tarkibiy o'zgarishlar tufayli promotor, saylenser va enxnser birlashadi va boshqaruvchi oqsillar transkripsiya omillari yoki RNK polimeraza bilan o'zaro ta'sirlashadi. Pro-mRNK oqsil sintezi uchun matritsa rolini o'ynashi uchun u prosessing davri (ishlov berish) bosqichidan o'tishi kerak. Ushbu davrning asosiy hodisasi pro-mRNK-dan intronlarga mos keladigan qismlarni olib tashlash va qolgan ekzonlarni yagona zanjirga ulashdir. Ekzonlarni "bog'lash" jarayoni splaysing deb nomlanadi. Splaysingni amalga oshirishda mayda yadroviy RNK (snRNA) va oqsillar katta rol o'ynaydi. Jarayon barcha eukaryotlarda xuddi shunday davom etadi. SnRNA molekulalari ham pro-mRNK bilan, ham bir-biri bilan bir-birini to'ldiruvchi o'zaro ta'sir o'tkazadilar. Ular intronlarni olib tashlashni ta'minlaydi va ekzonlarni bir-biriga yaqin tutadilar. Splaysing jarayoni tabiatda alternativ bo'lishi mumkin, ya'ni. ekzonlarni o'zaro bog'lash turli kombinatsiyalarda amalga oshirilishi mumkin.
Ko'pgina genlarda o'nlab yoki undan ortiq ekzon mavjud, shuning uchun yetuk mRNK variantlari soni = 2n, bu erda n - ekzononlar soni. Alternativ ravishda taqsimlash ma'lumotni yozib olish tizimini tejamkor qiladi, chunki turli xil oqsillarni sintez qilish uchun bitta gendan ma'lumot olish mumkin. Bundan tashqari, u ma'lum bir protein mahsulotidagi hujayralar ehtiyojlariga qarab ma'lumot oqimini boshqarish imkoniyatini yaratadi. Xususan, immunoglobulinlar, transkripsiya omillari va boshqa oqsillarni sintez qilishda alternativ splaysing qo'llaniladi, mRNKning to'liq kamolotga chiqishi ikkala uchning modifikatsiyasini o'z ichiga oladi: 5'-uchidan qopqoq tuzilishini biriktirish va 3'-uchidan poliadenil zanjirini biriktirish. Kepning tuzilishi guanin nukleotidining 5'-uchidagi mRNKning terminal bazasiga birikishi natijasida hosil bo'ladi.[11]
Eukaryotlardagi translyatsiya mexanizmi prokaryotikdan tubdan farq qilmaydi. Shu bilan birga, oqsillarni sintez qilishning ushbu bosqichida xizmat qiladigan oqsillarni translyatsiya qilish omillari bakteriyalarga qaraganda ancha ko'pdir. Eukaryotik genomning tuzilishini tavsiflashda xromosomalarning ixtisoslashgan terminali - telomeralar haqida aytmaslik mumkin emas. Telomerik DNK ko'p marta takrorlanadigan qisqa nukleotidlarning bloklaridan iborat. Birinchi marta telomerik DNK 6-8 juft nukleotidlarning bloklaridan tashkil topgan bir hujayrali protozoada o'rganildi. Bir zanjirda bu TTGGGG (G-boy zanjir) blok, ikkinchisida - AACCCC (C-boy zanjir). Odamlarda bu ketma-ketlik bitta TTAGGG bazasi bilan ajralib turadi, o'simliklarda universal TTTAGGG bloki mavjud. Odamlarda telomerik DNK uzunligi 2 dan 20 ming bp gacha Telomerik DNK hech qachon transkripsiya qilinmaydi va sun'iy sattelit DNK tarkibiga kiradi. Telomeraza fermenti xromosomalarning telomerik hududlari bilan o'zaro ta'sir qiladi, ularda yuzaga keladigan zararni yo'q qiladi. Hujayra qisqarishi ushbu ferment faolligining pasayishi natijasida tugaydigan qismlarning yo'qolishi natijasida telomerlarning qisqarishi bilan bog'liq.
Prokaryotik genom bilan taqqoslaganda, eukaryotik genomning ishlashi o'rtasidagi sezilarli farq genlar ta'sirini boshqarishning ko'p bosqichli tabiati hisoblanadi. Prokaryotlarda faqat bitta turdagi boshqarish mumkin - operon tizimidan foydalangan holda transkripsiya darajasida. Eukaryotlarda, genlarning uzluksiz tuzilishi tufayli, ushbu boshqarish turiga transkriptiv (splaysing, modifikatsiya) tartibga solish va translyatsiya darajasida (tarjima noaniqligi) qo'shiladi. Bundan tashqari, xromosomalarda gistonlar mavjudligi DNKning strukturaviy o'zgarishi mexanizmi yordamida xromosomalarning faol (euxromatik) holatdan faol (geteroxromatik) holatga o'tishi mexanizmini ishlatib, genlarning ta'sirini guruh tomonidan nazorat qilish imkonini beradi. Bunday o'zgarishlar ba'zan butun xromosomalarga va hatto butun genomga ta'sir qiladi. Xromosoma boshqaruvi darajasiga misol sutemizuvchi va odam hujayralarida jinsiy xromatin (Barr tanalari) hosil bo'lishidir. Bu ikkita X xromosomasidan biri bo'lgan eng kondensatli va shuning uchun harakatsiz bo'lgan xromatinning katta donasidir . Butun genomning inaktivatsiyasiga misol hayvonlarda spermatogenez jarayoni bo'lib, uning davomida barcha sperma xromosomalari kondensatsiya bilan ushlanib qoladi va bu ularni harakatsiz qiladi. Bu mikroorganizmlarning DNKiga zarar yetganda (masalan, nurlanganda) himoya mexanizmidir. Agar ularda yuzaga keladigan mutatsiyalar ularni o'limga olib kelmasa, embrionni ajratish paytida erkak genomining funktsional faolligi tiklanganidagina ro'y berishi mumkin. Biroq, aksariyat mutatsiyalarning resessivligi, hech bo'lmaganda keyingi avlodgacha (gomozigoz holatiga o'tishdan oldin) yoki hatto uni yo'q qilgunga qadar ularning mumkin bo'lgan namoyon bo'lishiga turtki beradi .