Kerakli asboblar va reaktivlar: probirkalari bilan shtativ, pipetkalar, sentrifuga, spektrofotometr, suv hammomi Perxlorat kislotasining 0,2 n va 0,5 n eritmasi. Ishning borishi

Mavzu. DNK ajratish uchun namunalar yig`ish, eritmalar va asboblarni tayyorlash. Turli metodlar yordamida o`simlik to`qimalaridan genom DNK ajratish.
Metod purin va pirimidin asoslari ultrabinafsha nurlarining
260-280 nm to’lqin uzunligidagi qismini yutishga asoslangan. Hayvon to’qimasidagi umumiy nuklein kislotalarining miqdorini aniqlash metodini A.S.Spirin yaratgan bo’lib, kislotada eruvchi nukleotidlar sovutilgan 0,2 n xlor kislotasi bilan ajratib olinadi, nuklein
kislotalarning ekstraksiyasi va gidrolizi 0,5 n xlor kislotasi bilan 100° C da olib boriladi, ekstraktlarning optik zichligi 270 va 290 nm to’lqin uzunligida aniqlanadi va formula bo’yicha hisoblanadi.
Kerakli asboblar va reaktivlar: probirkalari bilan shtativ, pipetkalar, sentrifuga, spektrofotometr, suv hammomi.1. Perxlorat kislotasining 0,2 n va 0,5 n eritmasi.
Ishning borishi: 100-200 mg to’qima tortib, maydalanadi va sentrifuga stakaniga solib, unga 5-10 ml sovutilgan 0,2 n xlor kislotasi eritmasidan qo’shiladi. Stakanlardagi suyuqlik yaxshilab aralashtiriladi, so’ngra 3000 ayl/min tezligida 5 minut sentrifuga qilinadi. Sentrifugat tashab yuboriladi, cho’kmaga esa 5-10 ml 0,5 n H2SO4 kislotasini eritmasidan qo’shiladi va probirkalar qaynab turgan suv hammomiga 20 minut qo’yiladi. Gidrolizat sovutilib, sentrifuga qilinadi hamda spektrofotometrda 270 va 290 nm to’lqin uzunligida kontrol 0,5 n H2SO4 eritmasiga nisbatan o’lchanadi, optik zichligi aniqlanadi. 1 ml tekshirilayotgan eritmaning nuklein kislotasidagi fosfor miqdori mkg da hisoblanadi.

D₂₇₀-D₂₉₀

C_mkgP_t= _{___________ _______}
0,19 _{___________________________________________________________________________________________________________-}

Bunda 0,19-1 ml eritma nuklein kislota tarkibidagi fosforning (1 mkg) optik zichlik ko’rsatkichi. Nuklein kislotalarning miqdori ularning tarkibidagi fosforga qarab hisoblanadi va bunda o’rtacha hisoblash koeffitsiyenti 10,3 qo’llanadi.

C _mkg NK=C _mkg R₁.10,3
10,3 – o’rtacha hisoblash koeffitsiyenti.


Nazorat savollari:
1.Tajribadan kuzatilgan natijalarini ketma-ketlikda sxematik tarzda ifodalang.
2.Hayvon to’qimasidagi nuklein kislotalarining umumiy miqdorini aniqlash tartibini aytib bering.


DNK gidrolizi mahsulotlarini xromotografiya usulida identifikasiya qilish.

Dneasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Germany) reagentlar to‘plami afzalligi jinsiy voyaga yetgan nematodalarning 10 mg to‘qimasidan tashqari, juda kichik o‘lchamdagi nematodalarning lichinkasi yoki tuxumidan genom DNK sini ajratib olish mumkin (4-rasm).

Bunda nematoda to‘qimasining kichik bo‘lagi ajratib olinadi yoki pipetka bilan 1-2 dona lichinka yoki tuxumi olinadi va 1,5 ml li “Ependorf” probirkasiga solinadi. Namunalar og‘irligi 10 mg dan oshmasligi kerak. Biologik materialga 180 mkl ATL buferi solinadi. 20 mkl proteinaza K qo‘shiladi va vorteksda 15 sek davomida aralashtiriladi. Probirkalar termostatda 55° C haroratda biologik materialning to‘liq parchalanishiga qadar inkubatsiya qilinadi. Namunalarni 1-3 soatga yoki kechasiga 18 soatga qoldirish mumkin. 15 sek davomida vorteks qilinadi, keyin 200 AL buferi qo‘shilib, 15 sek vorteksda aralashtiriladi, 70° C haroratda 10 minut inkubatsiya qilinadi.
So‘ngra 200 mkl etanol (96-100% li) qo‘shib, vorteksda gomogen eritma hosil bo‘lguncha aralashtiriladi. Har bir gomogen ehtiyotkorlik bilan
(Dneasy Mini spin column) filtrli epindorf probirkalarga solinib, qopqoqlari berkitilib 1 minut davomida 8000 ayl/min tezlikda sentrifuga qilinadi. Epindorfga o‘tgan toza suyuqlikni 2 ml li probirkalarga o‘tkazilib, ustiga 500 mkl AW1 solinib 1 minut davomida 8000 ayl/min tezlikda sentrifuga qilinadi.
Toza suyuqlikni 2 ml li filtirli probirkalarga o‘tkazilib, ustiga 500 mkl AW2 bufer solinib filtrdan suyuqlik to‘liq ajralguncha 14 000 ayl/min tezlikda 3 minut davomida sentrifuga qilinadi. Filtrli epindorfni boshqa 1,5 ml li yoki 2 ml li probirkalarga o‘tkaziladi va ustiga 50-100 mkl AE bufer yoki distillangan suv solinadi, so‘ngra xona haroratida 2 minut inkubatsiya qilinadi va 8000 ayl/min tezlikda 1 minut sentrifuga qilinadi.
Buferda erigan DNK -20° C haroratda saqlanadi. Eluat olish jarayonini 8-bosqichga ko‘ra takrorlash mumkin. Bundan tashqari, hozirgi vaqtda nuklein kislotalarni avtomatik ravishda ajratib olish uchun bir necha priborlar ishlab chiqarilgan. 4-rasm. MagPurix 12s tizimi yordamida NK avtomatik ravishda ajratib olish bosqichlari. NK ajratib olishda moddalarni ajratishda magnit shariklari yordamiga asoslangan.





Nazorat savollari:
1.Tajribadan kuzatilgan natijalarini ketma-ketlikda sxematik tarzda ifodalang.
2. Nematodalarning lichinkasi yoki tuxumidan genom DNK sini ajratib olish tartibi haqida gapiring.