Kafedrasi “biotexnologiya” fanidan o‘quv-uslubiy majmua

III. Fermentlarni immobilizatsiya qilish usullari.
Fermentlarni immobilizatsiya qilishning ikkita asosiy usuli mavjud: fizik va kimyoviy.
Fermentlarning jismoniy immobilizatsiyasi bu fermentni unga umumiy hajmning atigi cheklangan qismi qo'shilishi mumkin bo'lgan muhitga kiritilishi. Jismoniy immobilizatsiya jarayonida ferment kovalent aloqalar orqali tashuvchiga bog'lanmaydi.
Fermentning bog’lanishida to'rt xil tur mavjud:
- erimaydigan tashuvchilarda adsorbtsiya;
- Gel bo'shlig'iga kiritish;
- fermentni reaktsiya tizimining qolgan qismidan fazoviy ajratish, yarim o'tkazuvchan septum (membrana) yordamida;
- ferment eriydigan va faqat fazalardan birida bo'lishi mumkin bo'lgan ikki fazali muhitga kiritish. Adsorbtsion immobilizatsiya fermentlarni immobilizatsiya qilishning mavjud bo'lgan eng qadimgi usullaridan biri bo'lib, u 1916 yilda boshlangan. Bu usul juda sodda va fermentning suvli eritmasi tashuvchisi bilan aloqa qilish orqali erishiladi. Adsorbsiyalanmagan oqsilni yuvgandan so'ng, immobilizatsiya qilingan ferment foydalanish uchun tayyor bo'ladi. Adsorbtsiyalangan ferment molekulasining tashuvchisi yuzasida saqlanishiga van der Waalsning o'ziga xos bo'lmagan o'zaro ta'siri, vodorod aloqalari, tashuvchisi va oqsilning sirt guruhlari orasidagi elektrostatik va gidrofobik o'zaro ta'sirlar tufayli erishish mumkin. Har bir bog'lanish turining hissasi tashuvchining kimyoviy tabiatiga va ferment molekulasi yuzasidagi funktsional guruhlarga bog'liq. Tashuvchi bilan o'zaro ta'sirlar shunchalik kuchli bo'lishi mumkinki, biokatalizatorning sorbsiyasi uning tuzilishini buzishi bilan birga keladi. Masalan, sitodex granulalarida ba'zi o'simlik hujayralari adsorbsiyasi natijasida hujayra devori deformatsiyalanadi, bu tashuvchi zarrachalarning sirt relyefini takrorlaydi. Adsorbtsiya immobilizatsiyasi usulining afzalligi tashuvchisi sifatida ishlaydigan sorbentlarning mavjudligi va arzonligi. Gelda fermentlarni immobilizatsiya qilishning ikkita asosiy usuli mavjud. Ulardan birida ferment monomerning suvli eritmasiga joylashtiriladi, so'ngra polimerizatsiya amalga oshiriladi, buning natijasida ferment molekulalari bilan polimer gel hosil bo'ladi. Bifunksional o'zaro bog'lash agentlari (molekulada ikkita er-xotin aloqani o'z ichiga olgan) ko'pincha reaktsiya aralashmasiga qo'shilib, hosil bo'lgan polimerga uch o'lchovli tarmoq tuzilishini beradi.
Boshqa holatda, ferment tayyor polimer eritmasiga kiritiladi, keyinchalik u qandaydir tarzda gel holatiga o'tkaziladi. Polimer gelga kiritish orqali fermentlarni immobilizatsiya qilish usuli har qanday geometrik konfiguratsiyaga ega dori-darmonlarni yaratishga imkon beradi, shu bilan birga biokatalizatorning tashuvchisi hajmida bir tekis taqsimlanishini ta'minlaydi. Usul universal bo'lib, deyarli har qanday fermentlar, polienzim tizimlari, hujayra bo'laklari va hujayralarini immobilizatsiya qilish uchun qo'llaniladi. Gel tarkibidagi ferment bakterial infektsiya tufayli inaktivatsiyadan ishonchli himoyalangan, chunki katta bakterial hujayralar ingichka gözenekli polimer matritsasiga kira olmaydi. Shu bilan birga, ushbu matritsa substratning fermentga tarqalishi uchun muhim to'siqlarni keltirib chiqarishi mumkin, bu immobilizatsiya qilingan preparatning katalitik samaradorligini pasaytiradi, shuning uchun ushbu immobilizatsiya usuli yuqori molekulyar og'irlik ostidagi substratlarga umuman qo'llanilmaydi. Membranalar yordamida immobilizatsiya qiluvchi fermentlarning umumiy printsipi shundaki, fermentning suvli eritmasi substratning suvli eritmasidan yarimo'tkaziladigan qism bilan ajratiladi. Yarim o'tkazuvchan membrana substratning kichik molekulalarini osonlikcha o'tkazadi, ammo fermentning katta molekulalari uchun engish qiyin. Ushbu usulning mavjud modifikatsiyalari faqat yarim o'tkazuvchan membranani yaratish usullari va uning tabiati bilan farq qiladi. Fermentning suvli eritmasi ingichka polimer devori bilan yopilgan sferik vesikulalar bo'lgan mikrokapsulalar ichiga kiritilishi mumkin (mikroensapsulatsiya). Ikkita emulsifikatsiya bilan suvli emulsiya organik polimer eritmasining tomchilaridan olinadi, bu esa o'z navbatida fermentning suvli eritmasidan ham kichik tomchilarni o'z ichiga oladi. Bir muncha vaqt o'tgach, hal qiluvchi qotib, sferik polimer zarralarini hosil qiladi va ularda fermentlangan ferment bo'ladi. Agar suvda erimaydigan qotib qoladigan polimer o'rniga yuqori molekulyar og'irlikdagi suyuq uglevodorodlar ishlatilsa, bu usul suyuq membranalarga biriktirish orqali immobilizatsiya deb ataladi. Yarimo'tkazuvchan qobiq yordamida fermentlarni immobilizatsiya qilish usulining modifikatsiyalari tolalarga kiritishni ham o'z ichiga oladi (bu holda ferment o'z ichiga olgan tomchilar o'rniga iplar olinadi) va liposomalarga qo'shilish. Membran tipidagi tizimlardan foydalanish yuqori ferment tarkibiga ega immobilizatsiya qilingan preparatlarni olish imkonini beradi. Usul avvalgisiga o'xshab juda universaldir, ya'ni. ikkala ferment va hujayralarga, shuningdek ularning bo'laklariga ham tegishli. Sirtdan hajmgacha bo'lgan nisbati va membrananing kichik qalinligi tufayli fermentativ reaktsiyalar tezligida sezilarli diffuziya oldini olish mumkin.
Membranali tizimlarning asosiy kamchiligi bu yuqori molekulyar og'irlikdagi substratlarni fermentativ konversiyalashning mumkin emasligidir. Ikki fazali tizimlardan foydalangan holda fermentlarni immobilizatsiya qilishda, tizim hajmida fermentning harakatlanish erkinligini cheklash uning faqat bitta fazada erishi qobiliyati tufayli erishiladi. Substrat va ferment transformatsiyasining mahsuloti har ikki faza o'rtasida ushbu fazalardagi eruvchanligiga qarab taqsimlanadi. Fazalarning tabiati, ferment yo'q joyda mahsulot to'planib qoladigan tarzda tanlanadi. Reaksiya tugagandan so'ng, bu faza ajratiladi va undan mahsulot olinadi va fermentni o'z ichiga olgan faza keyingi jarayonni amalga oshirish uchun yana ishlatiladi. Bifazik tizimlarning eng muhim afzalliklaridan biri shundaki, ular cheklangan gözenek hajmiga ega bo'lgan qattiq tashuvchilardan foydalanishda mumkin bo'lmagan makromolekulyar substratlarni fermentativ ravishda o'zgartirishga imkon beradi. Immobilizatsiya kimyoviy usullarining ajralib turadigan xususiyati shundaki, ferment tarkibidagi kimyoviy o'zaro ta'sir natijasida uning molekulasida, xususan oqsil va tashuvchida yangi kovalent aloqalar vujudga keladi. Kimyoviy usul yordamida olingan immobilizatsiya qilingan fermentlarning preparatlari kamida ikkita muhim afzalliklarga ega. Birinchidan, fermentning tashuvchisi bilan kovalent aloqasi natijasida hosil bo'lgan konjugatning yuqori quvvatini ta'minlaydi. PH va harorat kabi turli xil sharoitlarda ferment tashuvchidan so'rilmaydi va u bilan katalizatsiyalangan reaktsiyaning maqsadli mahsulotlarini ifloslantirmaydi. Bu tibbiy va ovqatlanish jarayonlarini amalga oshirishda, shuningdek analitik tizimlarda barqaror, ko'paytiriladigan natijalarni ta'minlashda ayniqsa muhimdir. Ikkinchidan, fermentlarning kimyoviy modifikatsiyasi ularning xususiyatlarida, masalan substratning o'ziga xosligi, katalitik faolligi va barqarorligi kabi muhim o'zgarishlarga olib kelishi mumkin. Fermentlarni kimyoviy immobilizatsiya qilish darajasi, avvalambor, eksperimentatorning mahorati bilan belgilanadigan san'atdir. Eksperimentatorning asosiy vazifasi ferment molekulasida uning katalitik faolligini namoyon qilish uchun zarur bo'lmagan funktsional guruhlari yordamida yangi kovalent aloqalarni shakllantirishdir. Fermentning kimyoviy modifikatsiyasi bilan uning faol markazini himoya qilish maqsadga muvofiqdir. Turli xil immobilizatsiya usullarini taqqoslaganda, katta miqyosdagi biotexnologik jarayonlarning kimyoviy usullari murakkabligi va qimmatligi tufayli yoqimsiz bo'lib tuyuladi. Sanoat jarayonlarida odatda jismoniy immobilizatsiyaning ma'lum usullari qo'llaniladi. XX asrning 70-yillarida mikroorganizm hujayralarining immobilizatsiyasi to'g'risida birinchi nashrlar paydo bo'ldi va immobilizatsiyalangan hujayralarni birinchi sanoat ishlatilishi 1974 yilda Yaponiyada amalga oshirildi. Ularning yordami bilan aspartik kislota olindi. Immobilizatsiya qilingan hujayralar ham immobilizatsiya qilingan fermentlar, ham erkin hujayralarga nisbatan bir qator afzalliklarga ega:

• 
  fermentlarni ajratish va tozalash uchun xarajatlarning etishmasligi;
  
• 
  reaktsiya mahsulotlarini izolyatsiyalash va tozalash xarajatlarini kamaytirish;
  
• 
  yuqori faollik va barqarorlik;
  
• 
  uzluksiz va yarim doimiy uzluksiz avtomatlashtirilgan jarayonlarni yaratish qobiliyati;
  
• 
  ekzogen kofaktorlarsiz multenzim tizimlarining uzoq muddatli ishlash qobiliyati.
  

Immobilizatsiya uchun har xil sharoitda hujayralar ishlatilishi mumkin: turlicha va turli darajada zarar ko'rgan. Bir bosqichli reaktsiyalar tirik va zararlangan hujayralarni ham amalga oshirishi mumkin. Polyenzim reaktsiyalari uzoq vaqt davomida ATP va koenzimlarni (NADP, NAD) tiklay oladigan tirik hujayralar yordamida amalga oshiriladi.
Immobilizatsiya qilingan mikroorganizmlarning fermentativ faolligini qo'llash muammosi chuqur ildizlarga ega. 150 yildan ko'proq vaqt oldin sirka olishning tezkor usuli yog'och chiplarida adsorlangan mikroorganizmlardan foydalanishga asoslangan edi. Hujayra immobilizatsiyasi usullari ferment immobilizatsiya usullariga o'xshaydi. Kimyoviy usul faollashtirilgan tashuvchi bilan kovalent aloqalarni shakllantirishga, hujayra devoridagi faol guruhlar tufayli bifunktiv reaktivlar (masalan, glutaraldegid) bilan bog'lanishiga asoslangan.Fizik usullarga adsorbsiya va agregatsiya kiradi. Turli gellar, membranalar va tolalarni biriktirish orqali hujayralarni immobilizatsiyasi kimyoviy va fizik ta'sirga asoslangan. Kimyoviy usullar boshqa usullarga nisbatan kamroq ishlatiladi va tirik hujayralarni immobilizatsiya qilish uchun yaroqsiz. Hujayralarni gellar, membranalar va tolalarga kiritish juda keng tarqalgan. Ushbu immobilizatsiya usuli bilan hujayralar yashovchan bo'lib qolishi va ozuqaviy muhit mavjud bo'lganda gellarning sirt qatlamlarida ko'payishi mumkin. Butun immobilizatsiya qilingan hujayralarning biokatalitik faolligi endi fan va texnikaning turli sohalarida qo'llanilishi mumkin:
aminokislotalar, organik kislotalar, antibiotiklar, steroidlar, uglevodlar, uglevodorodlar, nukleotidlar va nukleozidlar kabi birikmalarning biosintezi va konversiyasida;
pivo va vinochilikda; oqava suvlar va tabiiy suvlarni tozalashda; oqava suvlardan metallarni olishda; quyosh energiyasini o'zlashtirish paytida; vodorodli quyosh batareyalari ishlab chiqarishda; azotni biriktirishda; elektrodlarni ishlab chiqarishda analitik maqsadlar uchun. marker sifatida plastidalar yoki xloraplaslar ishtrok etadi.