I bob. Fermentlarni immobilizatsiyalashtirish va biokatalitik tizimlar

II - BOB. FERMENTLARNI IMMOBILIZATSIYA QILISH USULLARI


2.1. Fermentlarni immobilizatsiya qilish

So'nggi 15-20 yil ichida fermentlar ishlab chiqarish texnologik sxemalarining to'liq tarkibiy qismlariga aylandi. Bunga fermentlarni immobilizatsiya qilish usullarini ishlab chiqish, ya'ni ularni erimaydigan materiallarga biriktirish orqali erishildi. Immobilizatsiya fermentlarning yo'q qilinishini oldini oladi, ularning amal qilish muddatini oshiradi, ularni heterojen katalizatorga aylantiradi (masalan, don shaklida).

Immobilizatsiya deganda ferment molekulasi suvda erimaydigan ma'lum ob'ektlarga (tashuvchilarga) birikishiga olib keladigan protsedura tushuniladi (eng. immobilis-harakatsiz). Ushbu ob'ektlar ferment bilan birgalikda reaktsiya tugagandan so'ng eritmadan osongina ajralib chiqadi. Fermentning tashuvchiga kimyoviy "tikilishi" fermentning konformatsiyasini ta'minlaydi va barqarorlikni oshirish va labillikning pasayishiga sabab bo'ladi.
Immobilizatsiyalangan fermentlar hujayrada tizimli ravishda tashkil etilgan fermentlar modeliga o'xshaydi (membrana ferment bilan aloqa qilish uchun bir xil erimaydigan asosdir). XX asr ma'lum kimyoviy va biologik fanlar chorrahasida yangi ilmiy va muhandislik yo'nalishi shakllandi: muhandislik enzimologiyasi (biotexnologiyaning eng muhim bo'limi), uning jadal rivojlanishi heterojen Bioorganik katalizatorlarning yangi turlarini yaratishga olib keldi – immobilizatsiyalangan fermentlar.
Mahalliy prekursorlar bilan taqqoslaganda, immobilizatsiyalangan fermentlar amaliy maqsadlarda ishlatilganda bir qator afzalliklarga ega.
Birinchidan, heterojen katalizator sifatida immobilizatsiya qilingan fermentni reaktsiya muhitidan osongina olib tashlash mumkin:
- reaktsiyani o'z vaqtida to'xtating;
- yana katalizatordan foydalaning;
- oziq-ovqat va farmatsevtika ishlab chiqarish uchun ayniqsa muhim bo'lgan ferment bilan ifloslanmagan mahsulotni oling.
Ikkinchidan, heterojen katalizatorlardan foydalanish enzimatik jarayonni doimiy ravishda, masalan, oqim ustunlarida amalga oshirishga imkon beradi va katalizlangan reaktsiya tezligini tartibga soladi va oqim tezligini o'zgartirib, mahsulot chiqishini tartibga soladi.
Uchinchidan, fermentning immobilizatsiyasi yoki modifikatsiyasi katalizatorlarning xususiyatlarini, shu jumladan uning o'ziga xosligini, katalitik faollikning pH, ion tarkibi va boshqa atrof-muhit parametrlariga bog'liqligini va, eng muhimi, uning turli xil denatüre ta'siriga nisbatan barqarorligini maqsadli o'zgartirishga yordam beradi.
To'rtinchidan, fermentlarning immobilizatsiyasi ma'lum fizik omillar (yorug'lik, ovoz va boshqalar) ta'siri ostida tashuvchining xususiyatlarini o'zgartirish orqali katalitik faolligini tartibga solish imkonini beradi.
Tashuvchilarning asosiy talablari:
- yuqori kimyoviy va biologik qarshilik;
- yuqori mexanik kuch;
- ferment va substratlar uchun etarli o'tkazuvchanlik;
- yuqori gözeneklilik;
- texnologik jihatdan qulay shakllar (granulalar, membranalar, quvurlar, plitalar va boshqalar);
- reaktsion shaklga oson o'tish (faollashtirish):
- yuqori hidrofiliklik, bu fermentni suv muhitida tashuvchiga bog'lash reaktsiyasini amalga oshirish imkoniyatini beradi;
- arzon narx.
Fermentlarni immobilizatsiya qilish uchun materiallar (tashuvchilar).
J. Ga Ko'ra. Poratu (1974), fermentlarni immobilizatsiya qilish uchun ishlatiladigan ideal materiallar quyidagi xususiyatlarga ega bo'lishi kerak:
1.Erimaydi;
2.Yuqori kimyoviy va biologik qarshilik;
3.Muhim hidrofilik;
4.Fermentlar va substratlar va reaktsiya mahsulotlari uchun etarli o'tkazuvchanlik;
5. Tashuvchining qobiliyatini faollashtirish oson.
Tabiatga qarab, tashuvchilar quyidagilarga bo'linadi:
1. Organik materiallar;
2. Noorganik materiallar.
Organik polimer tashuvchilarni 2 sinfiga bo'lish mumkin:
a) tabiiy;
b) sintetik.
O'z navbatida, organik polimer tashuvchilarning har bir klassi ularning tuzilishiga qarab guruhlarga bo'linadi. Tabiiy polimerlar orasida: protein; polisakkarid; lipid tashuvchilar va sintetik moddalar orasida:
- polimetilen;
- poliamid;
- polyester.
Tabiiy tashuvchilarning afzalliklari quyidagilardan iborat
1. Mavjudligi;
2. Ko'p funktsiyali;
3. Hidrofillik
Kamchiliklar orasida-yuqori narx.
Immobilizatsiya uchun polisakkaridlardan eng ko'p foydalaniladi: tsellyuloza, dekstran, agaroza va ularning hosilalari. Kimyoviy barqarorlikni ta'minlash uchun ularning chiziqli zanjirlari epiklorohidrin bilan o'zaro bog'langan. Olingan mesh tuzilmalariga turli xil ion guruhlari osongina kiritiladi.
Tabiiy aminosakkaridlardan chitin immobilizatsiya uchun tashuvchilar sifatida ishlatiladi, u Qisqichbaqa va qisqichbaqalarni sanoat qayta ishlash jarayonida katta miqdorda chiqindilar sifatida to'planadi. Chitin kimyoviy jihatdan chidamli va yaxshi aniqlangan gözenekli tuzilishga ega.
Oqsillar orasida keratin, fibroin, kollagen va kollagenni qayta ishlash mahsuloti – jelatin kabi tarkibiy oqsillar tashuvchilar sifatida amaliy qo'llanildi. Ushbu oqsillar tabiatda keng tarqalgan, shuning uchun ular ko'p miqdorda mavjud, arzon va fermentni bog'lash uchun juda ko'p funktsional guruhlarga ega. Proteinlar biotexnologik maqsadlar uchun immobilizatsiyalangan fermentlarni loyihalashda juda muhim bo'lgan biodegradatsiyaga qodir.
Sintetik polimer tashuvchilar orasida stirol, akril kislotasi, polivinil spirti, poliamid va poliuretan polimerlari mavjud.
Ularning afzalliklari:
1.Mexanik kuch;
2.Ko'zlarning kattaligini va turli funktsional guruhlarni joriy qilishni keng miqyosda o'zgartirish imkoniyati.
Sintetik polimerlar quvurlar, tolalar, granulalar kabi mahsulotlarda ko'paytiriladi. Bu xususiyatlar fermentlarni immobilizatsiya qilishning turli usullari uchun foydalidir.
Noorganik tashuvchilarning asosiy afzalligi-yangilanish qulayligi. Sintetik polimerlar singari, noorganik tashuvchilar ham har qanday shaklni berishlari va har qanday gözeneklilik darajasi bilan olishlari mumkin. Shunday qilib, bugungi kunda fermentlarni immobilizatsiya qilish uchun juda ko'p turli xil tashuvchilar yaratilgan. Biroq, ma'lum bir texnologik jarayonda ishlatiladigan har bir individual ferment uchun, vosita va immobilizatsiya shartlari va usullari uchun maqbul variantlarni tanlash kerak.
Immobilizatsiyalangan fermentlar bardoshli va erkin fermentlarga qaraganda o'n minglab marta barqarordir. Shunday qilib, 65% poliakrilamid Jelda immobilizatsiya qilingan laktat dehidrogenazning 60° C haroratda sodir bo'ladigan termoaktivatsiyasi mahalliy fermentga nisbatan 3600 marta sekinlashadi.
Bu immobilizatsiyalangan fermentlarni ishlatadigan texnologiyalarning yuqori samaradorligi, samaradorligi va raqobatbardoshligini ta'minlaydi.
Immobilizatsiya erimaydigan materialdagi fermentlarning fizik adsorbsiyasi, jel hujayralariga fermentlarni kiritish, shuningdek, fermentni erimaydigan materialga yoki ferment molekulalariga kovalent bog'lash orqali erimaydigan poliferment komplekslarini hosil qilish orqali amalga oshiriladi. Adsorbentlar shisha, silika jeli, gidroksiapatit, tsellyuloza va uning hosilalari, chitin, dekstran va boshqalarni qanday ishlatadi. Fermentlarni kovalent bog'lash uchun material sifatida polipeptidlar, oqsillar, stirol hosilalari, poliakrilamid, neylon, turli xil tsellyuloza hosilalari, kraxmal, agar, agaroz, shuningdek shisha, silika jeli va boshqalar qo'llaniladi.
Fermentlarni immobilizatsiya qilishda afinaviy xromatografiya bilan bir xil printsiplar qo'llaniladi. Afinaviy xromatografiya chiqarilgan biopolimer yoki polimerlar guruhining ma'lum bir modda bilan biospesifik o'zaro ta'siriga asoslanadi. Kromatografiyaning bu turi fermentlar, immunoglobulinlar, retseptor oqsillari uchun ishlatiladi, ular substratlarga, retseptorlarga, antijenlarga, ingibitorlarga, kofaktorlarga selektiv ravishda birikishi mumkin. Xromatografiyaning ushbu usulining printsipi shundaki, erimaydigan vositada oqsil bilan bog'lanishi mumkin bo'lgan modda o'rnatiladi. Ushbu modda ligand deb ataladi. Shu tarzda qayta ishlangan vosita (adsorbent) ustunga joylashtiriladi va u orqali oqsillar aralashmasi o'tadi. Faqat ma'lum bir ligand bilan yaqin bo'lgan protein adsorbent bilan bog'lanadi. Keyin oqsil ustundan eritma bilan chiqariladi, bu protein va ligand o'rtasida hosil bo'lgan kompleksning ajralishiga olib keladi.
Ma'lumki, hujayralardagi fermentlar erigan shaklda emas, balki ma'lum tuzilmalarga biriktirilgan va organellalarda lokalizatsiya qilingan. Buning sababi shundaki, fermentlar barqaror birikmalar emas va bir qator fizik va kimyoviy omillar ta'sirida inaktivatsiyalanishi mumkin.
Yuqorida aytib o'tganimizdek, immobilizatsiya qilingan fermentlar (lat. immobiiis-harakatsiz), ferment preparatlari, ularning molekulalari matritsa yoki tashuvchi (odatda polimer) bilan bog'liq bo'lib, katalitik xususiyatlarini to'liq yoki qisman saqlab turadi. Immobilizatsiyalangan fermentlar odatda suvda erimaydi. Ikki bosqich o'rtasida substrat molekulalari, katalitik reaktsiya mahsulotlari, inhibitorlar va aktivatorlar almashinuvi mumkin. Fermentlarni immobilizatsiya qilishning bir necha asosiy usullari mavjud:
1) yutish usuli
1) ferment va matritsa o'rtasida kovalent aloqalarni shakllantirish orqali;
2) bir vaqtning o'zida polimer to'riga kiritilgan ferment ishtirokida matritsani tashkil etuvchi monomerning polimerizatsiyasi – odatda jel;
3) qarama-qarshi zaryadlangan ferment va matritsa guruhlarining elektrostatik o'zaro ta'siri;
4) matritsani tashkil etuvchi ferment va monomerni kopolimerizatsiya qilish;
5) kovalent bo'lmagan o'zaro ta'sirlar natijasida ferment va matritsani bog'lash – hidrofobik, vodorod aloqalarini shakllantirish va boshqalar.;
6) encapsulation-masalan, liposomaların enzim kiritish, yarim-geçirgen kapsula ferment molekulalari yaqin yaratish;
7), masalan, glutar aldegid, adipik kislota dimetil Eter bilan bir-biriga ferment molekulalarini o'zaro bog'lash orqali.
Ferment immobilizatsiyasining ikkita tubdan farq qiluvchi usuli mavjud:
1.Ferment va tashuvchi o'rtasida kovalent aloqalarsiz (immobilizatsiyaning fizik usullari);
2.Ular orasidagi kovalent aloqani shakllantirish (immobilizatsiyaning kimyoviy usullari).
Ushbu usullarning har biri turli yo'llar bilan amalga oshiriladi (1-rasm).

Adsorbsion immobilizatsiya fermentlarni immobilizatsiya qilishning mavjud usullaridan eng qadimgi hisoblanadi, uning boshlanishi 1916 yilda boshlangan. Adsorbsiyalanmagan oqsilni yuvgandan so'ng, immobilizatsiyalangan ferment foydalanishga tayyor. Adsorbsiyalangan ferment molekulasini tashuvchining yuzasida ushlab turish vodorod aloqalari, tashuvchi va oqsilning sirt guruhlari o'rtasidagi elektrostatik va hidrofobik o'zaro ta'sirlar bilan ta'minlanishi mumkin. Bog'lanish turlarining har birining hissasi ferment molekulasining yuzasida tashuvchining kimyoviy xususiyatiga va funktsional guruhlarga bog'liq. Tashuvchining o'zaro ta'siri shunchalik kuchli bo'lishi mumkinki, biokatalizatorning sorbsiyasi uning tuzilishini yo'q qilish bilan birga bo'lishi mumkin. Masalan, sitodeks granulalarida ba'zi o'simlik hujayralarining adsorbsiyasi bilan hujayra devori deformatsiyalanadi va tashuvchining zarralari yuzasining yengilligini takrorlaydi. Adsorbsion immobilizatsiya usulining afzalligi-bu tashuvchilar sifatida ishlaydigan sorbentlarning mavjudligi va arzonligi. Ular, shuningdek, har qanday konfiguratsiyani berilishi va zarur g'ovaklikka ta'minlash mumkin. Muhim omil-ishlatiladigan usullarning soddaligi. Adsorbsion bog'lanish bilan fermentni tozalash muammosini hal qilish mumkin, chunki ko'p hollarda oqsilni tashuvchiga bog'lash juda o'ziga xosdir. Afsuski, fermentni tashuvchiga ulash kuchi har doim ham etarlicha yuqori emas, bu usulni qo'llashni cheklaydi. Adsorbsion immobilizatsiyaning kamchiliklari ma'lum bir fermentning to'g'ri tashuvchisini tanlash va optimal immobilizatsiya sharoitlarini, shuningdek fermentning tashuvchiga ulanishining past kuchini ta'minlaydigan umumiy tavsiyalarning etishmasligini o'z ichiga oladi. Immobilizatsiya sharoitlari o'zgarganda, fermentning desorbsiyasi, uning yo'qolishi va mahsulotlarning ifloslanishi mumkin. Fermentning tashuvchiga ulash kuchini sezilarli darajada oshirish uchun uni oldindan o'zgartirish mumkin (metall ionlari, polimerlar, oqsillar, hidrofobik birikmalar, lipid monosli bilan ishlov berish).
Jelga kiritish orqali fermentlarni immobilizatsiya qilish.
Ushbu immobilizatsiya usulining mohiyati shundaki, ferment molekulalari jelni hosil qiluvchi bir-biriga bog'langan polimer zanjirlarining uch o'lchovli to'riga kiritilgan. Jeldagi qo'shni zanjirlar orasidagi o'rtacha masofa kiritilgan ferment molekulasining kattaligidan kichikdir, shuning uchun u polimer matritsani tark eta olmaydi va atrofdagi eritmaga, ya'ni immobilizatsiya qilingan holatda bo'ladi. Jel to'rida fermentni ushlab turishga qo'shimcha hissa qo'shish ferment molekulasi va uning atrofidagi polimer zanjirlari o'rtasidagi ion va vodorod aloqalarini ham o'z ichiga olishi mumkin. Jeldagi polimer zanjirlar orasidagi bo'shliq suv bilan to'ldiriladi, bu odatda jelning umumiy hajmining katta qismini tashkil qiladi. Masalan, polimer kontsentratsiyasiga va uning tabiatiga qarab akril kislota polimerlarining keng tarqalgan jellari 50 dan 90% gacha suvni o'z ichiga oladi.
Jeldagi fermentlarni immobilizatsiya qilishning ikkita asosiy usuli mavjud. Ulardan biri bilan ferment monomerning suvli eritmasiga joylashtiriladi va keyin polimerizatsiya amalga oshiriladi, natijada unga kiritilgan ferment molekulalari bilan polimer jel hosil bo'ladi. Reaksiya aralashmasiga tez-tez hosil bo'lgan polimerga uch o'lchovli panjara tuzilishini beradigan bifunksional (molekulada ikkita juft bog'lanishni o'z ichiga olgan) o'zaro bog'lanish agentlari qo'shiladi. Boshqa holda, ferment tayyor polimer eritmasiga kiritiladi, keyinchalik u jelga o'xshash holatga o'tkaziladi. Polimer jelga kiritish orqali fermentlarni immobilizatsiya qilish usuli har qanday geometrik konfiguratsiyaga tayyorgarlik ko'rish imkonini beradi, shu bilan birga biokatalizatorni tashuvchining hajmida bir xil taqsimlashni ta'minlaydi. Usul universal bo'lib, deyarli har qanday fermentlarni, poliferment tizimlarini, hujayra qismlarini va hujayralarni immobilizatsiya qilish uchun qo'llaniladi. Jelga kiritilgan ferment barqaror, bakterial infektsiya tufayli inaktivatsiyadan ishonchli himoyalangan, chunki katta bakteriyalar hujayralari mayda gözenekli polimer matritsasiga kira olmaydi. Shu bilan birga, bu matritsa substratning fermentga tarqalishi uchun muhim to'siqlarni keltirib chiqarishi mumkin, bu immobilizatsiyalangan preparatning katalitik samaradorligini pasaytiradi, shuning uchun yuqori molekulyar og'irlikdagi substratlar uchun bu immobilizatsiya usuli umuman qo'llanilmaydi.
Jellardagi fermentlarning immobilizatsiyasi fermentning tashuvchining hajmida bir xil taqsimlanishini ta'minlaydi. Barcha jellar yuqori mexanik, kimyoviy, issiqlik va biologik qarshilikka ega va uning tarkibiga kiritilgan fermentni qayta ishlatish imkoniyatini beradi.
Fermentlarni yarim o'tkazuvchan tuzilmalarga immobilizatsiya qilish (enzimlarni liposomalarga kiritish va kiritish).
Immobilizatsiyaning ushbu usullarining mohiyati fermentning suvli eritmasini substratning suvli eritmasidan yarim o'tkazuvchan membrana bilan ajratish, past molekulyar og'irlikdagi substrat molekulalarini o'tkazish, ammo fermentning katta molekulalarini ushlab turishdir. Ushbu yo'nalishdagi ikkita modifikatsiyani ishlab chiqdi, ular mikrokapsulatsiya va liposomalarga fermentlarni kiritishdir.
Kapsülasyon usuli 1974 yilda T. chang tomonidan ishlab chiqilgan va fermentning suvli eritmasi devorlari yarim o'tkazuvchan polimer yoki membrana hosil bo'lgan yopiq mikrokapsulaga kiritilganligi. Fermentning suvli mikrokapsulalari yuzasida membrananing paydo bo'lish mexanizmlaridan biri bu ikkita birikmaning o'zaro fazaviy polikonsistensiyasining reaktsiyasi bo'lib, ulardan biri suvda, ikkinchisi organik fazada eriydi.
Olingan kapsulalarning hajmi yuzlab mikrometr, membrananing qalinligi esa mikrometrning yuzdan bir qismidir.
Mikrokapsulyatsiya usulining afzalligi soddaligi, ko'p qirraliligi, mahalliy fermentni qayta ishlatish qobiliyatidir, chunki uni oddiy filtrlash usuli bilan reagent bo'lmagan substratdan ajratish mumkin. Mikrokapsulatsiya usuli bilan nafaqat individual fermentlar, balki butun hujayralar va alohida hujayra qismlari ham immobilizatsiya qilinishi mumkin. Usulning kamchiliklari kapsüllü fermentlarning yuqori molekulyar substratlarni konvertatsiya qilish qobiliyatini o'z ichiga olishi kerak.
Immobilizatsiya uchun inkapsulatsiyaga yaqin bo'lgan variant liposomalarda fermentlarning suvli eritmalarini, ya'ni er-xotin lipid (yog') to'plarini kiritish usuli hisoblanadi. Ushbu usul birinchi marta j fermentlarini immobilizatsiya qilish uchun ishlatilgan. Weisman va J. J. 1970 yilda sessiya. Liposomalarni lipid eritmalaridan (ko'pincha lesitin) olish uchun organik erituvchi bug'lanadi. Qolgan ingichka lipid plyonkasi fermentni o'z ichiga olgan suvli eritmada saqlanadi. Ta'sir qilish jarayonida liposomaning lipid tuzilmalarini o'z-o'zidan yig'ish (o'z-o'zini yig'ish) sodir bo'ladi. Liposomalar tarkibiga kiritish orqali immobilizatsiya qilingan fermentlar asosan tibbiy va biotexnologik maqsadlarda qo'llaniladi.
Fermentlarni immobilizatsiya qilishning kimyoviy usullari. Ushbu usullar ferment va tashuvchi o'rtasida yangi kovalent aloqalarni shakllantirish orqali fermentlarning immobilizatsiyasini anglatadi – sanoat biokatalizatorlarini ishlab chiqarishning eng katta usuli.
Jismoniy variantlardan farqli o'laroq, bu immobilizatsiya usullari fermentning tashuvchiga mustahkam va qaytarib bo'lmaydigan bog'lanishini ta'minlaydi va ferment molekulasining barqarorlashuvi bilan birga keladi. Biroq, fermentning tashuvchiga nisbatan bitta kovalent bog'lanish masofasida joylashishi katalitik jarayonni amalga oshirishda qiyinchiliklarni keltirib chiqaradi. Fermentlar ommaviy axborot vositasidan bromosiyanin, gidrazin, glutar dialdegidning ko'p funksiyali agentlari bo'lgan qo'shimchalar (tikuv yoki spacer) yordamida ajratiladi. Bunday holda, immobilizatsiyalangan fermentning tuzilishi kovalent aloqalar bilan bog'langan tashuvchini, qo'shimchani va fermentni o'z ichiga oladi.
Immobilizatsiya kimyoviy usullarining asosiy farqlovchi xususiyati shundaki, uning molekulasida fermentning tuzilishiga kimyoviy ta'sir o'tkazish orqali yangi kovalent aloqalar, xususan oqsil va tashuvchi o'rtasida hosil bo'ladi. Kimyoviy usullar yordamida olingan immobilizatsiyalangan fermentlarning preparatlari kamida ikkita muhim afzalliklarga ega. Birinchidan, fermentning tashuvchiga kovalent aloqasi hosil bo'lgan konjugatning yuqori kuchini ta'minlaydi. PH va harorat kabi sharoitlarning keng tarqalishi bilan ferment tashuvchidan so'rilmaydi va u katalizatsiyalangan reaktsiyaning maqsadli mahsulotlarini ifloslantirmaydi. Bu, ayniqsa, tibbiy va oziq-ovqat jarayonlarini amalga oshirishda, shuningdek, analitik tizimlarda barqaror, takrorlanadigan natijalarni ta'minlashda muhimdir. Ikkinchidan, fermentlarning kimyoviy modifikatsiyasi substratning o'ziga xosligi, katalitik faolligi va barqarorligi kabi xususiyatlarida sezilarli o'zgarishlarga olib kelishi mumkin. Fermentlarning kimyoviy immobilizatsiyasi-bu san'at, uning darajasi, birinchi navbatda, eksperimentatorning qobiliyati bilan belgilanadi. Eksperimentatorning asosiy vazifasi uning katalitik faolligini namoyon qilish uchun ahamiyatsiz bo'lgan funktsional guruhlaridan foydalanganda ferment molekulasida yangi kovalent aloqalarni shakllantirishdir. Fermentning kimyoviy modifikatsiyasi bilan uning faol markazini himoya qilish tavsiya etiladi. Turli immobilizatsiya usullarini taqqoslashda keng ko'lamli biotexnologik jarayonlar uchun kimyoviy usullar murakkablik va yuqori narx tufayli yoqimsiz ko'rinadi. Sanoat jarayonlarida odatda jismoniy immobilizatsiyaning ma'lum usullari qo'llaniladi.