Termiz davlat universiteti botanika kafedrasi

20-21-LABORATORIYA MASHG’ULOTI

Polimeraza zanjir reaksiyasi yordamida DNK bo’laklarini ko’paytirish



DNK-polimeraza halqali reaksiya yordamida (PSR) aniqlash

Kerakli reaktivlar: 3,8% li natriy sitrat, DNK ajratish uchun DiatomTM DNA Prep 200 reagentlar to’plami («Izogen laboratoriyasi»), PZR o’tkazish uchun GenePakTM PZR Core liofilizatsiyalangan reagentlar to’plami, “Sintol” firmasining real vaqtdagi PZR o’tkazish uchun reagentlar to’plami, agaroza, bromfenol-ko’ki, etidium bromid, marker (100 j.n., Sintol), TBYe bufer uchun tris, bor kislotasi va EDTA, 70% va 96% li etil spirti, dN₂O.

Asbob va jihozlar: 1. PZR- amplifikator– Applied Biosystems 9700;

2. Real vaqtdagi(Real-time PCR) PZR-amplifikator– Applied Biosystems 7500, AQSH

2. Transillyuminator– WiseDoc, Koreya;

3. Sentrifuga– Eppendorf 5417C, Germaniya;

4. Vorteks –FLV-2400N, Combi-Spin, BIOSAN;

5. Elektroforez uskunalari– helicon;

6. Energiya manbai– Elf-4, DNK-texnologiya, Rossiya;

7. Elektron tarozi– Denver INSTRUMENT, APX-203;

8. Ditsillyator– Thermo scientific, AQSH;

9.Eppendorf probirkalari 1 ml, 0,2 ml;

10. Mikroto’lqinli pech;

11. Mikropipetkalar – Labpette;

12. Sovutgich va muzlatgich – 4 ⁰C, - 20 ⁰C li;

13. Termostat – Termit, DNK-texnologiya;

14.Kimyoviy idishlar.

Ajratilgan DNK PSR metodi yordamida aniqlanildi. CYP21geni bo’yicha PSRni o’tkazishda GenePakTM PSR Core liofilizatsiyalangan reagentlar to’plamidan (OOO “Laboratoriya IzoGen”, Moskva, Rossiya) foydalanildi. Bu reagentlar to’plamiga quyidagilar kiradi:

• 
  (+) control (musbat kontrol namuna);
  
• 
  (-) control (manfiy kontrol namuna);
  
• 
  MasterMix (MasterMiks): tarkibida liofilizatsiyalangan quruq, ingibirlangan holatdagi Taq-DNK-polimeraza, dezoksinukleotidtrifosfatlar va magniy xlorid, shuningdek, standart PSR amplifikatsiyani o’tkazish uchun ishlatiladigan optimallashtirilgan bufer sistemani tutadi;
  
• 
  PSR Diluent (PSR erituvchi);
  
• 
  PSR Oil (PSR uchun yog’).
  

Shunday qilib, PSR amplifikatsiyasini GenePakTM PSR Core liofilizatsiyalangan reagentlar to’plami bilan o’tkazish quyidagi ketma-ketlikda amalga oshirildi:

1. 
   Reaksiya o’tkazishdan oldin muzlatgichdan kerakli miqdorda Master Miks probirkalari olindi.
   
2. 
   Master Miks probirkalarini (+), (-) tarzida belgilandi – nazorat va tekshirilayotgan namuna.
   
3. 
   Hamma probirkalarga – nazorat va tekshirilayotgan namunalarga PSR eritmasidan (Diluent) 10 mkl solindi. Probirkadagi aralashmani ataylab eritish shart emas.
   
4. 
   Hamma probirkalarga 2,5 mkl dan praymerlar solindi. Praymerlar konsentratsiyasi 0,1-0,5 mkM.
   
5. 
   Master Miks probirkalariga 5 mkl dan DNK solindi. (-) nazoratga distillangan suv solindi.
   
6. 
   Probirkalarni og’zini yopgan holda PSR-amplifikatoriga qo’yildi va tegishli amplifikatsiya dasturi tanlandi. Amlifikatsiya PSR- amplifikator (Applied Biosytsems 9700) uskunasida o’tkazildi.