147
Никитина А.В.
1
, Акиншина Ю.А.
1
, Нищакова Н.Е.
1
, Амелина Е.А.
1
, Марданлы С.Г.
2
1
ЗАО «ЭКОлаб», г.Электрогорск;
2
Государственный гуманитарно-технологический университет, г. Орехово-Зуево
В соответствии со статистическими данными в
стране и в мире наблюдается
стойкая тенденция к снижению заболеваемости сифилисом. Однако эпидемиологическая
ситуация остается напряженной в связи с изменением структуры инфекционного
процесса:
отмечается
увеличение
количества
случаев
асимптоматичной
инфицированности, нейросифилиса и резистентных форм. Эти процессы связывают, в
частности, с бесконтрольным приёмом антибиотиков,
влиянием сопутствующих
инфекций и недостаточным клинико-серологическим контролем. Перспективным
является создание высокоточных скрининговых методов диагностики, отвечающих
требованиям экономической эффективности.
Цель данной работы - разработать и оценить возможность применения
иммунохроматографического теста для определения антител к возбудителю сифилиса в
сыворотке и цельной крови человека.
Для проведения иммунохроматографического анализа (ИХА)
был разработан
экспресс-тест, представляющий собой пластиковую кассету с тестовой полоской,
состоящей из мембран разных видов. В специальное отверстие кассеты вносился
исследуемый образец сыворотки или цельной крови. После впитывания образца и
дальнейшей миграции жидкости вдоль тестовой полоски происходило связывание
специфических антител пробы с конъюгатом наночастиц (НЧ)
коллоидного золота и
рекомбинантных антигенов бледной трепонемы (р17, р47 и р41 (TmpA)) с образованием
иммунных комплексов. При достижении аналитической зоны с иммобилизованными
антигенами бледной трепонемы образованные ранее комплексы связывались с антигенами
на мембране, что проявлялось в тестовой зоне в виде полосы красного цвета различной
интенсивности. Верификация осуществлялась по наличию окрашенной полосы в
контрольной зоне теста.
148
Для
создания качественного теста, отвечающего требованиям экспрессности и
дешевизны анализа, предварительно была проведена серия оптимизационных
экспериментов. В процессе работы исследовались два вида аналитических мембран (CN
140, 10µm, Sartorius; Hi-Flow Plus 180, Millipore), отличающихся размером пор и временем
протекания жидкости, подбирались условия получения стабильных меченных НЧ золота и
сорбции иммунореагентов на мембрану, оценивалось влияние компонентов сыворотки и
цельной крови на результаты анализа, рассматривались способы устранения матрикс-
эффекта.
Для оценки работы теста и его аналитических характеристик
были проведены
исследования проб сыворотки крови, содержащих (n=90) и не содержащих
трепонемоспецифические антитела (n=48). Анализировались образцы цельной крови от
здоровых (n=12) и больных (n=6) пациентов. Исследуемые пробы готовой сыворотки и
выделенной из образцов цельной крови были
охарактеризованы с помощью
иммуноферментной тест-системы (ИФА) производства ЗАО «ЭКОлаб». Для
сравнительной
оценки
показателей
чувствительности
и
специфичности
иммунохроматографического теста все пробы были проанализированы в наборе для
реакции непрямой гемагглютинации («Сифилис-РПГА-тест», ЗАО «ЭКОлаб»).
В ходе экспериментальной работы были выбраны оптимальные условия для
получения конъюгатов (размер НЧ, значения рН растворов и степень нагрузки золя) и
иммуносорбента (концентрация реагентов и параметры их нанесения на аналитическую
мембрану, состав буферных растворов для обработки мембран для образца и суммарного
конъюгата). Для дальнейшей работы была выбрана аналитическая мембрана CN 140, при
использовании которой наблюдались максимальная интенсивность окрашивания,
отсутствие фонового сигнала и наибольшая чувствительность анализа. С
целью
устранения окрашивания тестовой зоны и снижения неспецифического взаимодействия
при исследовании образцов цельной крови было предложено использовать антитела к
эритроцитам человека в составе мембраны для образца.
При
анализе
положительных
в
ИФА
сывороток
крови
(n=90)
в
иммунохроматографическом тесте было получено совпадение результатов исследования в
92,2% (n=83) случаев в сравнении с ИФА и в 98,8% - в сравнении с РПГА. Для сывороток
крови, не содержащих (n=48) антитела к
T. Рallidum,
показатели составили 100% и 97,9%
(n=47) соответственно. Результаты анализа проб цельной крови полностью совпадали для
всех трёх методов.
149
В результате проведённой работы была разработана и оптимизирована тест-
система для выявления трепонемоспецифических антител методом ИХА в сыворотке и
цельной крови человека.
Тест был проверен на образцах, охарактеризованных в ИФА и
РПГА, и продемонстрировал высокую степень корреляции с другими методами в
сочетании со экспрессностью и простотой проведения анализа.
Список литературы.
1. Herring A., Ballard R., Mabey D., Peeling R. W.
WHO/TDR Sexually Transmitted
Diseases Diagnostics Initiative. Evaluation of rapid diagnostic tests: syphilis. Nature Reviews
Microbiology. 2006, 4 (12 Suppl.): 33–40.
2. Катунин Г. Л., Фриго Н. В., Ротанов С. В.
и др.
Анализ заболеваемости и
качества лабораторной диагностики нейросифилиса в Российской Федерации. Вестник
дерматологии и венерологии. 2011, № 3: 18–26.
Do'stlaringiz bilan baham: 
