Genomika asoslari

29-rasm. Western blotting uslubida elektroforez o’tkazish
Western blotting uslubi. Ba’zi hollarda organizmlardan izolyatsiya qilingan hujayra oqsillarini ma’lum hujayra antitanalar bilan o’zaro ta’sir qilishini aniqlash uchun Western blotting usuli qo’llaniladi. Western blot yoki immunoblot uslubi oqsillarni antitanalar orqali aniqlashga asoslangan. Reaksiya birinchi bosqichida poliakrilamid gelida denaturasiyaga uchragan oqsillar uzunligi bo’yicha yoki oqsil nativ holati uchlamchi strukturasiga ko’ra, SDS tasirida elektroforez o’tkaziladi. Keyinchalik oqsillar natriysellyulozaali yo’ki PVDF- membranalarga o’tkaziladi va oqsillarga nisbatan maxsus bo’lgan monoklonal yo’ki poliklonal antitanalar yordamida deteksiya qilinadi (25-rasm). Western blotting molekulyar biologiya, biokimyo, genetika va boshqa sohalarga keng qo’llaniladi. Xuddi shunga o’xshash, immunoenzim- ELISA yoki immunobo’yash uslublari ham oqsillarni maxsus antitanalar yordamida aniqlashda ishlatiladi. Western blotting uslubi George Stark tomonidan Stenford Univeriteti laboratoriyasida ishlab chiqilgan bo’lib, western blot nomlanishi W.Neal Burnett tomonidan berilgan. Uslub nomlanishi southern-blotting DNK ni aniqlash texnologiyasini aniqlagan Edvin Southern nomiga atalgan va western-blotting uslubi shunga asosan nomlangan. Huddi shuningdek, analogiyada RNK ni aniqlash uslubi Northering- blotting deb ataladi va oqsillar modifikasiyasining post translyasion deteksiyasi uslubi Eastern blotting deb nomlanadi (29-rasm).

30-rasm. Western blotting sxemasi. Oqsillar elektroforez (1) bilan ajralib, membranaga (2) o’tkaziladi. Keyin membrana birinchi (3) va ikkinchi (4) antitanalar bilan ishlanadi, shundan keyin antitanalar bilan bog’langan oqsillar aniqlanadi.

Mass-spektrometriya. Mass-spektrometriya o’rganilayotgan birikmalarning molekulyar og’irligini aniqlashga qaratilgan bir qator usullarni o’z ichiga oladi. U biologiyada , ayniqsa proteomikada keng qo’llanilishini mumkin. Mass-spektrometriya, mass –spektografiya yoki mass-spektrometrik tahlillarini o’z ichiga oladi va moddalarning kimyoviy, elementli va izotop tarkibiga qarab bu moddalarning konsentrasiyasini aniqlashda va identifikasiya qilishda qo’llaniladi. O’lchash asosini komponentlar ionizasiyasi hizmat qiladi va massaning zaryadga nisbati asosida modda tarkibini tashkil etuvchi komponentlarni aniqlash, ion tokining intensivligini o’lchash va modda tarkibidagi har bir komponentning hissasini hisoblab chiqish, ya’ni moddaning mass-spektrini aniqlash tashkil qiladi. Har bir komponentning kimyoviy tabiatiga ko’ra, kelib chiqishi va o’ziga xos xususiyatlarga ega bo’lishini hisobga olsak, mass-spektrometriya tibbiyotda, biologiya va sanoatda katta ahamiyatga egadir. Mass-spektrlarni hosil qilish uchun birinchi navbatda, organik yoki noorganik moddani tashkil etuvchi neytral molekula va atomlarni zaryadlangan ionlarga aylantirish lozim. Bu jarayonga ionizasiya deb ataladi, organik va noorganik moddalar uchun turlicha o’tkaziladi. Ikkinchi navbatda, asosiy shartlardan biri mass-spektrometrning vakuum qismida ionlarni gaz holatiga o’tkaish lozim bo’ladi. Mass-spektrometrlardagi vakuum qismlari chuqur bo’lib, ionlar uning ichida to’siqsiz bemalol harakat qiladi, agar mass-spektrometrlarda vakuum qimlari bo’lmasa, ionlar tarqalib ketadi va rekombinasiyaga uchraydi, y’ni qaytadan zaryadlanmagan holatga qaytadi. Ko’pgina katta molekulyar massaga ega bo’lmagan molekulalar faqatgina bitta musbat va manfiy zaryadga ega bo’lishi mumkin. Molekula qanchalik katta bo’lsa, shunchalik ionizasiya vaqtida ko’p zaryadli ionga aylanish ehtimoli mavjud. Shuning uchun, bunday samara katta molekulalarda, masalan oqsillar, nuklein kislotalar va polimerlarda namoyon bo’ladi. Ionizasiyaning ayrim turlarida, masalan elektronlar bilan ta’sir ettirilganda, molekulalar bir nechta xarakterli qismlarga ajralishi mumkin, ushbu holat qo’shimcha identifikasiya qilish va noma’lum strukturalarni o’rganish imkonini beradi.
1980-yillarda mass-spektrometriya asosida molekulalarning nurga sezgir bo’lgan organik moddalar- matritsalar ishlatila boshlandi, shu bilan birga lazer yordamida ionlashtiruvchi usul ishlab chiqildi. Matritsa o’rganilayotgan moddaning molekulalarini o’rab oladi va lazer ta’sirida qo’shni molekulalarni ionlashtiradi. Yangi ionlash usuli an’anaviy mass- spektrometr detektori bilan birlashtirildi- MALDI-TOF deb atala boshladi. Ushbu detektorda ionlar vakuum trubkasida harakatlanib, detektor bo’lgan sezgir plastinkaga yetib boradi. Ion naychaning uzunligini bosib o’tadigan vaqt uning massasiga teskari proportsionaldir. 1990-yillarda va 2000-yillarning boshlarida oqsillarni o’rganish uchun MALDI-TOF usuli juda faol ishlatilgan. MALDI-TOF yordamida patogen mikroorganizmlarni aniq tur va turga qarab aniqlash mumkin. Proteomikani saraton kasalliklarini tashxislash uchun oqsil biomarkerlari tahlili yordamida, shuningdek o’smaning malignanlik darajasini aniqlash imkoniyati o’rganilmoqda. Ushbu yo’nalishda allaqachon ma’lum yutuqlarga erishilgan. Masalan, Qo’shma Shtatlarda 2015 yilda ishlab chiqilgan Xpresys Lung testiga ruxsat beriladi, unda bir nechta plazma oqsillarining maqsadli mass-spektrometriyasidan foydalaniladi va o’pkada o’sma tugunlarining malignanligi darajasi baholanadi.
Proteomikaning so’nggi yutuqlari – mass-spektrometriya, organellalar oqsillari va membrana oqsillarini ajratish – yurak proteomini o’rganish va modifikatsiyalangan oqsillarni aniqlash shuningdek, ularning modifikatsiyasining xususiyatini aniqlash imkoniyatini yaratishi mumkin. Yurak proteomidagi ma’lumotlar turli yurak-qon tomir kasalliklari mexanizmlarini tushunishga yordam beradi.
Proteomikada bioinformatika. Mass-spektrometriya va chiplar yordamida oqsil bo’laklari haqida ma’lumot olish mumkin, lekin ushbu uslublar oqsillarning to’liq strukturasi haqida ma’lumot bera olmaydi. Shu munosabat bilan, bugungi kunda mass-spektrometriya ma’lumotlari va mikrosxemalardan o’rganilgan oqsil bo’laklaridan deyarli to’liq yig’ilgan oqsillar to’g’risida ma’lumot beradigan dasturlar yaratildi. Ushbu dasturlar UniProt va PROSITE ma’lumotlar bazalari asosidagi oqsillar kichik ketma-ketliklarining tahrirlariga asoslangan. Oqsillarni tahlil qiladigan dasturlarning aksariyati ularning translyatsiyadan keyingi modifikatsiyasini hisobga olmaydi. Translatsiyadan keyingi modifikatsiyani aniqlaydigan mavjud vositalar faqat taxminiy xarakterga ega.
Biomarker oqsillarini o’rganish uchun bioinformatikaning hisoblash usullari faol qo’llaniladi. Shunday qilib, kompyuter modellari yordamida homiladorlik paytida ona organizmi va homila o’rtasida intensiv ravishda oqsil almashinuvini ko’rsatish mumkin va tahlil uchun onadan faqat invaziv bo’lmagan qon namunalari talab qilinadi. Genom ketma-ketliklaridan olingan ma’lumotlarni tasdiqlash uchun proteomika usullaridan foydalanadigan proteogenomika kabi yo’nalish rivojlanmoqda. Shuningdek, rentgen difraksiyasini tahlil qilish va NMR spektroskopiyasi ma’lumotlari asosida oqsil tuzilmalarini keng miqyosda o’rganish bilan shug’ullanadigan tarkibiy proteomika mavjud.
Proteomika va tizimlar biologiyasi. Miqdoriy proteomikaning so’nggi yutuqlari tizimlarni chuqur tahlil qilish uchun ishlatishga imkon beradi. Turli xil ta’sirlarga, tashqi omillarning harakatlari, hujayra tsiklining turli bosqichlari bilan bog’liq holda hujayra fiziologiyasining o’zgarishiga javoban biologik tizimlarning xatti-harakatlarini ta’riflash ko’plab biologik jarayonlarning mohiyatini chuqur anglashga imkon beradi. Shu tufayli proteomika genomika, transkriptomika, epigenomika, metabolomika kabi ilmiy yo’nalishlar – tizimlar biologiyasiga kiritilgan. Shunday qilib, saraton hujayralari proteomining atlasi, inglizcha Proteome Cancer Atlas tarkibida ushbu oqsillar uchun genom va transkriptom ma’lumotlarni o’z ichiga olgan, saraton genom atlasini ing. The Cancer Genome Atlas da taxminan 200 dan ortiq 4000 dan ortiq tahlil qilingan o’sma namunalaridagi oqsillarning ekspressiyasi to’g’risida miqdoriy ma’lumotlar mavjud. Proteomika usullari asosida ishlab chiqilgan dori-darmonlarning maqsadga muvofiqligini tasdiqlash, biomarkerlarning samaradorligini aniqlash va dori ta’sir mexanizmi va uning toksikligini o’rganish uchun ishlatiladi. Bir-biri bilan bog’liq bo’lmagan ikki organizmning proteomlarini taqqoslash, bu ikki organizm uchun umumiy bo’lgan ikkala oqsilni va ularning fenotiplaridagi farqlarni aniqlaydigan oqsillarni aniqlashga imkon beradi. Bunday tahlil evolyutsion jarayonni tushunish uchun foydali bo’lgan ma’lumotni berishi mumkin va ba’zida bu oqsillarning ilgari noma’lum funktsiyalarini aniqlashga imkon beradi.