Микробиологический метод получения аминокислот, наиболее распро-
страненный в настоящее время, основан на способности микроорганизмов
синтезировать все L-аминокислоты, а в определенных условиях – обеспечи-
вать их сверхсинтез. Биосинтез аминокислот в микробных клетках протека-
ет в виде так называемых свободных аминокислот или «пула аминокислот»,
из которого в процессах конструктивного метаболизма синтезируются кле-
точные макромолекулы. Для синтеза всех белков требуется 20 аминокислот.
Пути синтеза большинства аминокислот взаимосвязаны. При этом одни
аминокислоты являются предшественниками для биосинтеза других. Пиру-
ват является предшественником аланина, валина, лейцина; 3-фосфоглицерат
– серина, глицина, цистеина; щавелево-уксусная кислота – аспартата, аспа-
рагина, метионина, лизина, треонина, изолейцина;
α-кетоглутаровая кислота
– глутамата, глутамина, аргинина, пролина; фосфоэнолпируват+эритрозо-4-
фосфат – фенилаланина, тирозина, триптофана; 5-фосфорибозил-1-
пирофосфат + АТФ – гистидина. Синтез каждой аминокислоты в микроб-
ных клетках реализуется в строго определенных количествах, обеспечи-
вающих образование последующих аминокислот, и находится под строгим
генетическим контролем. Контроль осуществляется по принципу обратной
связи на уровне генов, ответственных за синтез соответствующих фермен-
тов (репрессия), и на уровне самих ферментов, которые в результате избыт-
ка образующихся аминокислот могут изменять свою активность (ретроинги-
бирование). Данный механизм контроля исключает перепроизводство ами-
нокислот и также препятствует их выделению из клеток в окружающую
среду. Чтобы добиться сверхсинтеза отдельных аминокислот, нужно обойти
или изменить данный контрольный механизм их синтеза. Для первого пути
возможно использование природных «диких» штаммов; очень существенны
при этом условия ферментации, так как добиться дисбаланса в системе син-
теза аминокислот можно путем изменения ряда основных факторов среды
(концентрация основного субстрата, рН, соотношение макро- и микроэле-
55
ментов в среде и др.). Изменение контрольного механизма синтеза амино-
кислот осуществляется генетическими методами. При этом получают му-
тантные организмы: ауксотрофные и регуляторные мутанты. Ауксотрофные
мутанты – это организмы, утратившие способность к синтезу одной или
нескольких аминокислот.
Среди продуцентов аминокислот – различные микроорганизмы,
представители
родов Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus,
Aerobacter, Microbacterium, Eschirichia. Используемые в промышленно-
сти микроорганизмы можно подразделить на несколько классов: дикие
штаммы, ауксотрофные мутанты, регуляторные мутанты и ауксотроф-
ные регуляторные мутанты. Промышленные штаммы, как правило, не-
сут несколько мутаций, затрагивающих механизмы регуляции целевой
аминокислоты и ее предшественников.
Для получения таких аминокислот, как L-глутамата, L-валина, L-
аланина, L-глутамина и L-пролина возможно применение природных
штаммов и усиление у них продукции аминокислот условиями фермента-
ции. Например, высокий, до 30 г/л, выход глутамата возможен при пол-
ном или частичном подавлении активности a-кетоглутаратдегидрогеназы,
добавках в среду ПАВ и антибиотиков (пенициллина, цефалоспорина) для
увеличения проницаемости клеточных мембран для глутамата. Синтез L-
глутамата можно переключить на образование L-глутамина или L-
пролина, изменяя условия ферментации. При повышении концентрации
ионов аммония и биотина в среде стимулируется образование L-пролина;
слабо кислая среда и ионы цинка при избытке аммония усиливают синтез
L-глутамина.
Ауксотрофные мутанты используют в тех случаях, когда необходимо
синтезировать аминокислоты, являющиеся конечными продуктами раз-
ветвленных цепей метаболических реакций аминокислот. Например, для
получения L-лизина, L-треонина, L-метионина или L-изолейцина, для ко-
торых общим предшественником является L-аспартат, применяют мутан-
ты, ауксотрофные по гомосерину или треонину и гомосерину. Ауксо-
трофные мутанты не способны образовывать ингибиторы соответствую-
щего метаболического пути, работающие по принципу отрицательной
обратной связи из-за отсутствия определенной ключевой ферментативной
реакции. Поэтому при выращивании такого штамма в среде с минималь-
ной концентрацией необходимого ингредиента (аминокислоты) они спо-
собны на суперпродукцию аминокислоты-предшественника. Ауксотроф-
ные мутанты, способные накапливать конечные продукты неразветвлен-
ных цепей биосинтеза, например L-аргинина, невозможны. В данной си-
туации приходится получать мутанты с частично нарушенной регуляцией
биосинтеза, так как это позволяет повысить выход целевого продукта.
Такие организмы являются регуляторными мутантами.
56
Регуляторные мутанты отбирают по устойчивости к аналогам амино-
кислот либо среди ревертантов ауксотрофов. Аналоги аминокислот вы-
ступают в роли искусственных ингибиторов ферментов, работающих по
принципу обратной связи, одновременно обеспечивая биосинтез требуе-
мых аминокислот и подавляя процесс их включения в белки. Так, серусо-
держащий аналог лизина S-(2-аминоэтил)-L-цистеин является у
Brevibacterium flavum ложным и действует ингибитором аспартаткиназы
по принципу обратной связи. Поэтому устойчивые к его действию мутан-
ты, у которых выход лизина достигает 33 г/л, синтезируют фермент, в 100
раз менее чувствительный к ингибированию по механизму обратной свя-
зи, по сравнению с исходным штаммом. Регуляторные мутанты получают
путем трансдукции, проводя при этом отбор сначала отдельных мутаций,
вызывающих полное рассогласование механизмов регуляции, а затем объ-
единяя данные признаки путем ко-трансдукции. В результате этого, у од-
ного штамма можно последовательно закрепить устойчивость к несколь-
ким аналогам.
В последние годы для получения новых эффективных штаммов-
продуцентов аминокислот стали применять новейшие методы биотехно-
логии. Методы генетической инженерии позволяют повышать количество
генов биосинтеза путем их клонирования на плазмидах. Это приводит к
увеличению количества ферментов, ответственных за синтез аминокислот,
следовательно, повышает выход целевого продукта. Клонирование генов
системы синтеза аминокислот в клетки микроорганизмов с иным, по срав-
нению с донорским организмом, типом питания позволяет расширять
сырьевую базу и заменять дорогостоящие сахаросодержащие субстраты
более дешевыми.
Производственные биотехнологические процессы получения амино-
кислот реализуются в условиях глубинной аэробной периодической фер-
ментации. Скорость синтеза аминокислот не совпадает во времени со ско-
ростью роста производственной культуры (рис. 2.1).
Максимальная продукция аминокислоты наступает, как правило, когда
прирост биомассы практически прекращается. Поэтому питательная среда
на первом этапе ферментации должна обеспечивать сбалансированный
рост клеток; а на втором – условия для сверхсинтеза целевой аминокисло-
ты. В качестве источника углерода и энергии используют богатые сахаро-
содержащие субстраты, главным образом, мелассу. Возможно также при-
влечение более доступных субстратов (ацетат, сульфитный щелок, угле-
водороды). В зависимости от таксономического положения и физиологи-
ческих потребностей микроорганизмов в качестве источника азота ис-
пользуют соли аммония, нитраты, а также аминокислоты и молекулярный
азот. В состав среды вносят необходимые количества углерода и азота,
фосфатов и других солей, а также стимуляторы роста (витамины, дрожже-
вой экстракт), ПАВ, антибиотики. Периодический режим ферментации и
57
богатая по составу среда требуют соблюдения строгой стерильности в
ходе получения инокулята и на ферментационной стадии. Стерилизации
подвергаются питательная среда, воздух и все технологическое оборудо-
вание. После стадии ферментации в процессе обработки культуральной
жидкости клетки отделяют от раствора, который далее подвергают очист-
ке от окрашенных примесей и взвешенных частиц с помощью сорбцион-
ных методов. Далее процесс проводится с использованием различных ме-
тодов выделения и очистки в зависимости от сферы применения конечно-
го продукта. Для фармакологии и пищевой промышленности аминокисло-
ты выпускают в виде высушенных чистых кристаллических препаратов;
для кормовых и технических целей – используют стабилизированную и
сконцентрированную культуральную жидкость.
Do'stlaringiz bilan baham: |