207
моменты, когда они находятся в
неравновесных условиях, например, при нахождении ионов
субстрата в активном центре фермента или при прохождении иона через воротный механизм
мембранного канала. Таким образом, колеблющийся ион быстрее проходит через канал
биологической
мембраны, а колеблющаяся молекула субстрата быстрее находит нужное
положение «ключ-замок» в активном центре фермента (Узденский, 2000)..
Наиболее важным регуляторным ионом в клетке являются ионы кальция, так как они
являются внутриклеточными мессенджерами. Снаружи клетки в межклеточном пространстве
концентрация ионов кальция 10
–3
М, а внутри 10
-7
М. Для поддержания такой низкой
концентрации
ионов кальция внутри клетки, в плазматической мембране, мембранах
саркоплазматического ретикулума и митохондрий присутствуют активные насосы или
ионообменники, выкачивающие кальций наружу или закачивающие в ретикулум и
митохондрии. Даже небольшое увеличение концентрации внутриклеточного кальция
активирует множество кальций-зависимых ферментов и процессов.
Современным методом регистрации малых изменений концентрации внутриклеточного
кальция в диапазоне концентраций 10
-7
– 10
-6
М в живых
клетках является метод
флуоресцентных зондов. Он основан на свойстве специальных молекул Фура-2, Индо-1,
хлортетрациклин (ХТЦ) при присоединении к ним ионов кальция флуоресцировать (Левицкий,
1990).
Если резонансные гипотезы о влиянии НЧ ЭМП на биологические ионы верны, то
концентрация ионов кальция в цитоплазме растительных клеток будет изменяться в
зависимости от частоты внешнего ЭМП.
Целью настоящей работы явилась проверка этих резонансных гипотез на модели
растительной клетки – протопластах из листьев пшеницы.
Материалы и методы. Протопласты изолировали из листьев 6-8 дневных проростков
пшеницы с помощью 2,5%-ного фермента целлюлазы, как описано в Большом практикуме по
физиологии растений (1978). Концентрацию протопластов определяли подсчетом клеток в
камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивали по окраске клеток 0,04% трипановым
синим, она составляла во всех опытах не менее 95%. Плотность клеток в ячейке составляла 10
6
клеток/мл.
Протопласты инкубировали в среде содержащей 150 мМ Сахарозы, 150 мМ Na
2
SO
4
, 1 мМ
СаCl
2
, 10 мМ Трис-МЭС-буфер рН=7,1 и 20 мкМ Индо-1 в течение 1 часа.
Конечная концентрация клеток в измерительной ячейке флуориметра при флуоресценции
составляла 5 10
5
кл/мл для протопластов. Регистрацию интенсивности флуоресценции Индо-1
при 405 нм проводили на спектрофлуориметре СФР-1 (Пущино, Россия) при 25 С.
Длина волны
возбуждения – 334 нм.
Загруженные Индо-1 протопласты помещали в измерительную ячейку флуориметра в
среде с 1 мМ Са
2+
и обрабатывали еѐ импульсным ЭМП в диапазоне от 1 до 100 Гц.
Для обработки растительного материала ЭМП использовали самодельный генератор
электромагнитных импульсов, создающий затухающие пачки импульсов с частотой следования
пачек 1 - 100 Гц и магнитной индукцией 10 мкТл.
Результаты и их обсуждение. Было показано, что начиная с частоты 2 Гц возникают
скачкообразные преходящие изменения флуоресценции,
отражающие скачкообразные
изменения концентрации Са
2+
в цитоплазме клеток называемые кальциевые осцилляции.
При дальнейшем увеличении частоты эти осцилляции сливаются, образуя зависящие от
частоты различные уровни флуоресценции, которые уменьшаются при выключении генератора.
На рисунке 1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции от частоты в
диапазоне 1 – 100 Гц, из которой видно, что интенсивность флуоресценции максимальна на
частотах 1 - 50 Гц с пиками 16, 32 и 64 Гц.