Глава история изучения ферментов

2.3. Ферментные электроды
Классический потенциометрический ферментный электрод представляет собой комбинацию ионно-селективных электродов (ИСЭ) с иммобилизованным (нерастворимым) ферментом, который обеспечивает высокую селективность и чувствительность определения конкретного субстрата. Достоинством таких потенциометрических сенсоров являются простота оборудования (требуется только рН-метр), низкая стоимость, доступность большого числа хороших и надежных базовых ИСЭ. Концепция «растворимого» ферментного электрода впервые была выдвинута Кларком и Лайонсом в 1962 г.
Однако лишь в 1971 г. был создан первый ферментный электрод на основе глюкооксидазы, иммобилизованной в геле на поверхности полярографического кислородного электрода, который позволяет определять глюкозу в биологических жидкостях и тканях. Ферментные электроды могут работать и как вольтамперометрические, и как амперометрические датчики, то есть измеряется ток при приложенном постоянном напряжении. В 1969 г. Гилболт и Монталв предложили первый потенциометрический (измеряется потенциал системы без наложения внешнего напряжения) ферментный электрод для определения мочевины. В ферментных электродах ферменты обычно иммобилизуют, что позволяет уменьшить расход материалов для проведения анализов и исключить частую проверку ферментного препарата для получения воспроизводимых результатов.
Кроме того, устойчивость фермента часто увеличивается при введении его в подходящий гелевый носитель. Например, электрод для определения мочевины с химически связанной уреазой на поверхности аммонийного ИСЭ может работать более 300 дней. Для иммобилизации фермента используют два метода: химическую модификацию фермента введением групп, снижающих его растворимость, и физический захват фермента инертным носителем, например крахмалом или полиакриламидом. Для изготовления электродных датчиков более всего подходит химическая иммобилизация.
Функционирование ферментного электрода можно рассматривать как пятистадийный процесс, включающий:
1) подвод субстрата к поверхности электрода;
2) диффузию субстрата через мембрану активного центра;
3) реакцию в активном центре;
4) перенос продукта ферментативной реакции через мембрану к поверхности электрода;
5) определение продукта вблизи поверхности электрода.
Первая стадия - подвод субстрата - сильно зависит от скорости перемешивания раствора. Интенсивное перемешивание обеспечивает быстрый перенос субстрата к поверхности электрода. Если сделать мембрану очень тонкой и использовать высокоактивный фермент, то 2-я и 4-я стадии исключаются или оказывают минимальное влияние.
Стадия 3 также является очень быстрой, поэтому время отклика ферментного электрода теоретически должно быть близким к времени отклика базового электрода. Многие исследователи приводят экспериментальные данные, показывающие, что это достижимо при использовании тонкой мембраны и быстром перемешивании.
Ферментные электроды представляют собой биосенсоры, которые позволяют быстро и селективно проводить определение целого ряда компонентов в сложных по составу объектах. На основе использования ферментов созданы различные экспресс-тесты. Многие из них чрезвычайно просты.
Например, тест-устройство для определения токсичных фосфорсодержащих пестицидов в продуктах питания представляет собой бумажную полоску, один конец которой пропитан раствором хромогенного субстрата, а второй содержит иммобилизованную холинэстеразу. При анализе концы полоски совмещают и обмакивают в воду или в выжатый из фруктов или овощей сок. Т. к. пестициды в больших, чем предельно допустимых концентрациях (ПДК), количествах ингибируют холинэстеразу, то отсутствие окраски свидетельствует о превышении ПДК пестицидов.
Аналогичные бумажные тесты предложены для определения глюкозы в моче и крови. Широкое распространение получают иммуноферментные методы - разновидность иммунных методов анализа (радиоактивная или флуоресцентная метка заменяется ферментом). Их используют для определения иммуноглобулинов, гормонов, стероидов, лекарственных средств, пестицидов.
Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью. Для повышения воспроизводимости, экспрессности и производительности в ферментном методе анализа применяют автоматические анализаторы разного типа. Каталитические реакции с участием растворимых и иммобилизованных ферментов, а также ферментных реакторов все чаще используют в проточно-инжекционном анализе.
Ферментный метод анализа применяют в химическом анализе, но по сравнению с другими методами анализа, недостаточно широко. Из более чем 1800 полученных ферментов используют около 50.
Ферментные методы анализа позволяют определить селективно, а в некоторых случаях специфично такие биологически активные субстраты как глюкоза, мочевина и мочевая кислота, различные аминокислоты, липиды, холестерин, антибиотики, этиловый спирт и многие другие.
Разработаны чрезвычайно чувствительные методы определения многих ферментов (пероксидазы в крови, креатинфосфатазыв крови при диагностике инсульта и инфаркта миокарда и др.) и коферментов (никотинамиддинуклеотид, флавинмононуклкотид, АТФ и др.).
Основные области применения ферментных методов анализа - клиническая медицина и биохимия. С помощью ферментов в крови, моче, тканях и других биологических объектах определяют малые количества физиологически активных веществ, ферментов, мутагенов, канцерогенов, лекарственных препаратов. Высокочувствительный и специфический метод определения АТФ позволяет разрабатывать методики измерения количества клеток микроорганизмов, обнаружения микробных заражений, определения антибиотиков в биологических тканях и жидкостях по степени ингибирования микробных клеток.
Стабилизация ферментов. Исследователи из Швейцарии разработали способ стабилизации ферментов в условиях, характерных для пищеварительного тракта. Такая стабилизация достигается за счет связывания ферментов с полимерами.
Новый подход предлагает способ разработки лекарств белковой структуры, которые могут применяться перорально, не разрушаясь при таком приеме. Результаты работы также могут стать основой для разработки новой терапевтической стратегии, необходимой при лечении ряда заболеваний, связанных с аномальной активностью ферментов - например, глютеновой болезни.
Модификация ферментов полимерами для применения в фармацевтике не является чем-то новым - такой подход уже несколько лет применяется для увеличения времени жизни ферментов в организме и подавления любого иммунного отклика, связанного с работой ферментов. Тем не менее, даже такие модифицированные ферменты обычно вводятся в организм с помощью инъекций или другим способом, позволяющим обойти движение по желудочно-кишечному тракту.
Исследования, посвященные влиянию модификации ферментов на активность, которую они проявляют при пероральном приеме, проводились гораздо реже. Это связано с тем, что в ряде случаев модификация каталитически активного белка с целью защитить его от жестких условий, характерных для пищеварительной системы человека приводит к деградации белка или утрате им его биологической активности.
Жан-Кристоф Леру с коллегами из Швейцарского федерального технологического института решили продемонстрировать, что некоторые модификации полимеров могут стабилизировать ферменты в различных частях желудочно-кишечного тракта. Леру отмечает, что полученные в его группе результаты весьма важны, поскольку существует целый ряд болезней, для лечения которых важно разработать способ перорального введения лекарства. К таким заболеваниям относятся недостаточность поджелудочной железы, фенилкетонурия и глютеновая болезнь.
В течение нескольких лет исследователи из группы Леру работали над способами лечения глютеновой болезни - генетического аутоиммунного расстройства, связанного с неспособностью кишечника переваривать клейковину злаковых (глютен) и, в частности, один из основных компонентов глютена - глиадин. Решив первоначально выяснить, какое влияние оказывает модификация полимерами ферментов на их активность, исследователи модифицировали несколько ферментов, способных разрушать глютен различными полимерами и отслеживали, как такая модификация влияла на стабильность белков.
Как отмечает Леру, хотя и ожидалась некоторая степень стабилизации белков, исследователи к своему удивлению обнаружили, что дендронизированный полимер (полимер, обладающий линейной главной цепью и щеткообразными боковыми группами), значительно увеличивает стабильность глютеназы в желудочно-кишечном тракте.
Исследователи пока еще не до конца разобрались в механизме стабилизации фермента дендронизированным полимером. Одним из предположений является, что причиной повышения устойчивости является комбинация неспецифических взаимодействий фермент-полимер с действием муцина, присутствующего в пищеварительном тракте. Модифицированные ферменты более устойчивы к денатурации и деградации пепсином.