Черткова Екатерина Анатольевна

 

---

55 
2.6. Определение параметров иммунитета
2.6.1.Измерение интенсивности инкапсуляции 
Интенсивность процессов инкапсуляции у насекомых оценивали по степени 
потемнения нейлоновых имплантантов длиной 2 мм и диаметром 0.5 мм. 
Имплантанты вводили под кутикулу личинок 
G. mellonella
с вентральной 
стороны. Через 15 минут, 30 минут, 1 час, 4 часа и 24 часа имплантанты 
извлекали, фотографировали и измеряли степень потемнения капсулы c помощью 
программы Image J (Rantala, Roff, 2006; Dubovskiy et al., 2008, 2011). 
2.6.2.Определение активности фенолоксидаз в гемолимфе 
Активность фенолоксидаз у личинок вощинной огневки и колорадского жука 
определяли, используя метод Ashida и Söderhäll (1984) с модификациями. Отбор 
гемолимфы проводили индивидуально, выделяя 5 мкл гемолимфы в 20 мкл 
охлажденного 10 мМ фосфатного буфера pH 7.2 (ФБ), содержащего 1мМ 
ингибитора протеаз фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ). Полученную 
суспензию центрифугировали при 4°С в течение 5 мин при 500 g. К 15 мкл 
супернатанта, свободного от клеток, добавляли 250 мкл 10 мМ L-ДОФА и 
инкубировали в темноте при 28°С в течение 30 минут, после чего измеряли 
оптическую плотность при 490нм. Удельную активность фермента выражали в 
единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при 490 нм в 
ходе реакции в расчете на 1 мин и 1 мг белка (Dubovskiy et al., 2008). 
2.6.3. Определение концентрации белка 
Концентрацию белка в образцах гемолимфы насекомых определяли по 
методу М. Бредфорд (Bradford, 1976). Для построения калибровочной кривой 
использовали бычий сывороточный альбумин. 

---

56 
2.7. Определение уровня дофамина в гемолимфе насекомых