Bioorganik kimyo

Ishning borishi. elektroforez asbobining 4 ta shisha naychasi tagidan polietilen yoki rezinka plenkasi bilan berkitilib, vertikal sholatda o`rnatiladi va naychaning 15 shajmi bo`sh qolguncha polimerlashtirilgan initsiator solingan (quyishdan oldin qo`shiladi) monomer aralashmasi quyiladi.

Aralashma tarkibi: 40% monomer aralashmasi – 12-%gacha (C  3,3%, T  12%)*. pH 8,0 bo`lgan 0,2 M natriy fosfat – 0,1 M gacha. 10%-li DDS-Na - 0,1% gacha TEMED – bir ml gel’ uchun 2 mkl-gacha. 5% PSA (ammoniy persulfat) - shar bir ml gel’ uchun 10 mkl-gacha (to`ldirishdan oldin).

4 ta naychaning shammasiga bir xil shajmda aralashma quyiladi va tekis gel’ qavatini shosil qilish uchun tepasidan asta-sekin 0,1-0,2 ml suv qatlami shosil shilinadi. Polimerlanish tugagandan so`ng (gel’ bilan suv o`rtasida aniq chegara shosil bo`lganligi aniqlanadi). PAAG solingan naychaning tagidagi plenka olinib, yuqoridagi rezervuarga mashkamlanadi, Rezervuar pH 8,0 bo`lgan 0,1 M natriy fosfat, 0,1%-li DDS-Na elektrolit eritmasi bilan to`ldiriladi. Marker oqsilining namunalari shar bir naychaga 20 mkg-dan (20 mkg oqsil eritmasining 1 mgml 0,1 M fosfat buferi, 2,3%-gacha DDS-Na, 7% glitserin, 0,01% bromfenol ko`ki) solinadi, shu buferning o`zida kazein (5 mgml) shar bir naychaga 10- mkg dan solinadi.

Asbob platina elektrodlari yordamida o`zgarmas tok manbaiga ulanadi. elektroforez tokning kuchi shar naychaga 2 mA (shammasi 2 mA) yoki 8 vsm (taxminan 100 v) da 2 soat davomida reper bo`yog`i (bromfenol ko`ki) naychaning tagiga etguncha olib boriladi. elektroforez tugagach tok o`chiriladi, gel’ naychadan meditsina shritsi yordamida suvni gel’ bilan naycha ichki devori oralig`iga yuborish orqali ajratib olinadi. Geldagi oqsillar aloshida-aloshida probirkalarda 30 min davomida 25% TXU; 30 min davomida 10% sirka kislotasi tutgan 40%-li metanolda fiksatsiyalanadi va shundan so`ng kumassi yoki amid qorasi eritmasida (uy haroratida 2-4 soat, 60 S da 30-40 min) bo`yaladi. Ortiqcha bo`yoqni yuvish ko`p marotaba izo-propanol:sirka kislota:suv aralashmasini bilan olib boriladi. Oqsillarning geldagi joylashishi (turgan joyi) ko`k (binafsha-ko`k) yo`l sholatda, shar bir oqsil oralig`ining (yurgan masofasining) uzunligi gel’ chegarasidan (mm da) o`lchanadi, natijasi jadvalga yoziladi:

Oqsil	M	lgM	Oqsilning yurgan masofasi, mm	Rf

Oqsil yurgan masofasi (R_f) rener bo`yog`ining masofasiga nisbatan yoki oqsilning yuqoriga surilishi bilan (bu sholda RA) aniqlanadi. Jadvaldagi ma`lumotlar bo`yicha lgM ni R_f ga nisbatan grafigi chiziladi va kazein komponentlarining M aniqladi.

Elektroforez qo`yilgandan so`ng kazeinning pI ni aniqlashga kirishladi. Buning uchun 6 ta robirkaga 1 ml dan fiziologik eritmadagi kazeinning 2 mgml kontsentratsiyali eritmasi qo`yiladi va shar bir probirkaga 1 ml dan atsetat buferi (shar xil pH 3,5 dan 6 gacha) qo`shiladi. Probirkadagi aralashma aralashtiriladi va 30 minut sovuqxonada qoldiriladi. SHundan so`ng natija kuzatiladi. Barqaror cho`kma shosil qilgan pH ga teng bo`lgan probirka belgilanadi.

*T – geldagi akrilamid va bisakrilamidning umumiy kontsentratsiyasi, S – bisakrilamidning aralashmadagi nisbiy miqdori.