Biokimyo va molekulyar biologiya

CYP21genini amplifikatsiya qilish uchun ishlatilgan praymerlar:

Forward (U1-F)5’-GAGTACCTTGGAGGGCCTGCT-3’;

Reverse (F3-R) 3’-GCTACACTCCAGCGTCTGAGG-5’.
PZR-amplifikatsiyani o‘tkazishda quyidagi dastur yordamida olib borildi. PZR-amplifikatsiyasini o‘tkazish dasturi

Bosqich	Harorat,°C		Vaqt,min	Sikl
Denaturatsiya	95.0		4:00	1
	94.0		0:20	45
Renaturatsiya	64.0		0:40
Elongatsiya	72.0		3:00
YAkunlovchi elongatsiya	72.0	5:00		1

Amplifikatsiya tugagandan so‘ng, hamma probirkalarni elektroforez xonasiga ko‘chirildi va 5-10 mkl PZR mahsuloti 1,2 % elektroforez usuli bilan aniqlandi.

Real vaqtdagi (Real-time PZR) PZR-amplifikatsiyasini o‘tkazish TBGP bilan assotsiatsiyalangan CYP21 genida tez-tez uchrovchi mutatsiyalarni aniqlash uchun yangi DNK-diagnotsika sistemasi ishlab chiqarilgan bo‘lib, uning asosida Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya (Real-time Polymerase CHain Reaction) yotadi, tez-tez uchrovchi 8 ta mutatsiyalar uchun yangi allel-spetsifik praymer (qisqa oligonukleotid fragmentlari) va TaqMan zondi ishlatiladi. Avvaliga metod sun’iy matritsada test qilib ko‘rilgan, bunda yo‘nalishli mutagenez yordamida analiz qilinuvchi mutatsiyaga kiritiladi va keyin giperandrogeniyaning klinik va bioximik belgilari namoyon bo‘lgan 20 ta bemorning klinik materiali bo‘lgan DNK da tekshirilgan va ulardan bittasida mutatsiya topildi: u nonsens (nukleotidlar ketma-ketligi almashishi natijasida aminokislotalar o‘zgarishidan yoki stop kodon paydo bo‘lishi natijasida yuzaga keladigan mutatsiya) – mutatsiya +318X bo‘lib, aminokislotalarning o‘rin almashishidan kelib chiqadigan mutatsiya hisoblanadi. SHunday qilib, CYP21 genining PZR mahsulotlari real vaqtdagi PZR-amplifikatsiyada o‘tkazilib, natijada aniq natijalar olinadi.

Bu metod 5'-ekzonukleaza polimeraza faolligiga asoslangan. Reaktsion aralashmada muhim komponent hisoblangan DNK zondlar o‘zida 5' holatdagi fluoretssent bo‘yoq va 3' holatdagi fluoretssentsiyani o‘chiruvchi (masalan, FAM _TGATCGGGTGGAGTCCTGCC_BH1zondini oladigan bo‘lsak, bu erda FAM - fluoretssent bo‘yoq bo‘lsa, BH1 esa fluoretssentsiyani o‘chiruvchidir, ular orasida ma’lum bir nukleotidlar ketma-ketligi joylashgan) kabi qismlardan iborat hamda fosfat guruh 3' holatda joylashgan bo‘ladi. Bu zondlar amplifikatsiyalanayotgan sohada komplimentarlik asosida joylashadi. Fluoretssent o‘chiruvchi fluoretssent bo‘yoq tomonidan ajralayotgan yorug‘likni yutadi, fosfat guruhi esa 3' holatdagi polimerazani bloklaydi. Agar WT aralashmasi bo‘lgan namunada FAM flyuoretssent bo‘yog‘ini oshishi kuzatilsa C1994T mutatsiyasi namoyon bo‘lmaydi.

Geterozigota mutatsiyani mavjudligida esa bir vaqtning o‘zida Wild Type va Mutant aralashmalaridagi namunalarda flouressentsiya bo‘yoq – FAMni ko‘payishi kuzatiladi. Faqat Mutant aralashmasidagi namunalarda flyuretssentsiya bo‘yoq – FAMni ko‘payishi esa gomozigota mutatsiyadan darak beradi.