Biokimyo va molekulyar biologiya

 

30 – laboratoriya mashg`uloti

Polimeraza halqali (sepnaya) reaksiya (PZR) usuli bilan tanishish
Ajratilgan DNK PZR metodi yordamida aniqlanildi. CYP21geni bo‘yicha PZRni o‘tkazishda GenePakTM PZR Core liofilizatsiyalangan reagentlar to‘plamidan (OOO “Laboratoriya IzoGen”, Moskva, Rossiya) foydalanildi. Bu reagentlar to‘plamiga quyidagilar kiradi:

• 
  (+) control (musbat kontrol namuna);
  
• 
  (-) control (manfiy kontrol namuna);
  
• 
  MasterMix (MasterMiks): tarkibida liofilizatsiyalangan quruq, ingibirlangan holatdagi Taq-DNK-polimeraza, dezoksinukleotidtrifosfatlar va magniy xlorid, shuningdek, standart PZR amplifikatsiyani o‘tkazish uchun ishlatiladigan optimallashtirilgan bufer sistemani tutadi;
  
• 
  PZR Diluent (PZR erituvchi);
  
• 
  PZR Oil (PZR uchun yog‘).
  

SHunday qilib, PZR amplifikatsiyasini GenePakTM PZR Core liofilizatsiyalangan reagentlar to‘plami bilan o‘tkazish quyidagi ketma-ketlikda amalga oshirildi:

1. 
   Reaksiya o‘tkazishdan oldin muzlatgichdan kerakli miqdorda Master Miks probirkalari olindi.
   
2. 
   Master Miks probirkalarini (+), (-) tarzida belgilandi – nazorat va tekshirilayotgan namuna.
   
3. 
   Hamma probirkalarga – nazorat va tekshirilayotgan namunalarga PZR eritmasidan (Diluent) 10 mkl solindi. Probirkadagi aralashmani ataylab eritish shart emas.
   
4. 
   Hamma probirkalarga 2,5 mkl dan praymerlar solindi. Praymerlar konsentratsiyasi 0,1-0,5 mkM.
   
5. 
   Master Miks probirkalariga 5 mkl dan DNK solindi. (-) nazoratga biditsillangan suv solindi.
   
6. 
   Probirkalarni og‘zini yopgan holda PZR-amplifikatoriga qo‘yildi va tegishli amplifikatsiya dasturi tanlandi. Amlifikatsiya PZR- amplifikator (Applied Biosysems 9700) uskunasida o‘tkazildi.