Asosiy tushunchalar: Restriktaza fermentlari

Rekombinant plazmid olish
Kesish va ulash jarayonlari genni plazmidga kiritishda qanday ishlashini koʻrib chiqamiz. Tasavvur qiling, qoʻl ostimizda EcoRI taniydigan saytga ega boʻlgan gen va bitta EcoRI saytga ega plazmid bor:

Ish nishon gen va aylana plazmiddan boshlanadi. Nishon genning uchiga yaqin joyda ikkita EcoRI kesish sayti mavjud. Plazmidda bitta EcoRI sayti bor, u bakteriyalarda ekspressiyani ragʻbatlantiruvchi promoterdan keyin keladi. EcoRI saytlarining ketma-ketligi:
5ʼ-GAATTS-5ʼ 5ʼ-STTAAG-5ʼ
Bizning maqsadimiz – plazmidga gen kiritish uchun EcoRI fermentidan foydalanish. Dastlab gen parchasini va plazmidni EcoRI yordamida alohida-alohida kesamiz. Ushbu bosqich yopishqoq uchlari boʻlgan boʻlaklarni hosil qiladi:

Biz gen fragmentlari va plazmidni EcoRI yordamida parchalaymiz (boʻlaklarga boʻlamiz). Bu qadam yopishqoq uchlari boʻlgan boʻlaklarni hosil qiladi. Barcha oxirlar toʻrtta nukleotiddan iborat boʻlib, 5ʼ-AATT-3ʼ ketma-ketlikda joylashgan. Buning sababi EcoRI kesuvchi nuqta:
5ʼ-G|AATTS-5ʼ 5ʼ-STTAA|G-5ʼ
Keyin gen parchasini va chiziqli (ochilgan) plazmidni olib, ularni DNK ligazasi yordamida birlashtiramiz. Ikkala boʻlakning yopishqoq uchlari komplimentar asoslar orqali bir-biriga yopishadi:


Keyin gen boʻlagi va chiziqli (ochilgan) plazmid olinib, DNK ligazasi yordamida birlashtiriladi. Ikki boʻlakning yopishqoq uchlari komplimentar asos juftliklari yordamida bir-biriga yopishadi. Ammo gen va plazmid DNKsining oʻzaro ulanish nuqtalarida DNK juft spirali tarkibidagi uglevod-fosfat asosda boʻshliqlar mavjud.
Ligaza ularni birlashtirgandan soʻng, parchalar yaxlit DNKning bir boʻlagiga aylanadi. Natijada nishon gen plazmidga kiritilib, rekombinant plazmid hosil qilinadi.

Ularni ligaza birlashtirgandan soʻng, fragmentlar yaxlit DNKning bir boʻlagiga aylanadi. Endi nishon gen plazmidga kiritilib, rekombinant plazmid hosil qilinadi. Genning ikkita kesilgan uchi oʻzaro ulanishi natijasida ikkita EcoRI sayt yonma-yon joylashadi.