Article in animal · June 013 doi: 10. 1017/S1751731113001134 · Source: PubMed citations 22 reads 6,895 authors: Some of the authors of this publication are also working on these related projects

---

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: 

https://www.researchgate.net/publication/241690681

Advantages and disadvantages of the animal models v. in vitro studies in iron

metabolism: A review

Article

  

in

  

animal · June 2013

DOI: 10.1017/S1751731113001134 · Source: PubMed

CITATIONS

22

READS

6,895

2 authors:

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

biomodelo de ratas anémicas

 

View project

This work was supported by Andalusian Government, Excellence Research Project No. P11-AGR-7648

 

View project

Yenela García

Centro Nacional de Biopreparados, Cuba

25

 

PUBLICATIONS

   

82

 

CITATIONS

   

SEE PROFILE

Javier Díaz-Castro

University of Granada

141

 

PUBLICATIONS

   

1,476

 

CITATIONS

   

SEE PROFILE

All content following this page was uploaded by 

Yenela García

 on 23 July 2015.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

---

Animal

(2013),

7:10

, pp 1651–1658

&

The Animal Consortium 2013

doi:10.1017/S1751731113001134

animal

Advantages and disadvantages of the animal models

v. in vitro

studies in iron metabolism: a review

Y. Garcı´a

1

and J. Dı´az-Castro

2

-

1

Restorative Laboratory, National Centre of Biological Products, Mayabeque 6048, Cuba;

2

Department of Physiology and Institute of Nutrition and Food Technology,

University of Granada, E-18071 Granada, Spain

(Received 11 January 2013; Accepted 18 April 2013; First published online 21 June 2013)

Iron deficiency is the most common nutritional deficiency in the world. Special molecules have evolved for iron acquisition,

transport and storage in soluble, nontoxic forms. Studies about the effects of iron on health are focused on iron metabolism

or nutrition to prevent or treat iron deficiency and anemia. These studies are focused in two main aspects: (1) basic studies to

elucidate iron metabolism and (2) nutritional studies to evaluate the efficacy of iron supplementation to prevent or treat iron

deficiency and anemia. This paper reviews the advantages and disadvantages of the experimental models commonly used as well

as the methods that are more used in studies related to iron.

In vitro

studies have used different parts of the gut.

In vivo

studies

are done in humans and animals such as mice, rats, pigs and monkeys. Iron metabolism is a complex process that includes

interactions at the systemic level.

In vitro

studies, despite physiological differences to humans, are useful to increase knowledge

related to this essential micronutrient. Isotopic techniques are the most recommended in studies related to iron, but their high cost

and required logistic, making them difficult to use. The depletion–-repletion of hemoglobin is a method commonly used in animal

studies. Three depletion–-repletion techniques are mostly used: hemoglobin regeneration efficiency, relative biological values

(RBV) and metabolic balance, which are official methods of the association of official analytical chemists. These techniques are

well-validated to be used as studies related to iron and their results can be extrapolated to humans. Knowledge about the main

advantages and disadvantages of the

in vitro

and animal models, and methods used in these studies, could increase confidence

of researchers in the experimental results with less costs.

Keywords:

experimental models, iron metabolism,

in vitro studies, animal models

Implications

Iron deficiency is the most common nutritional deficiency

around the world and it is considered a major public health

problem. The mechanism and control of iron uptake by the gut

has puzzled investigators in both

in vivo

and

in vitro

studies.

A variety of experimental models have been used in studies

related to iron, however,

in vitro

systems or animal models

features different iron metabolism results compared with

humans. This review covers the main experimental models

commonly used in metabolic and nutritional studies of iron

homeostasis, including their advantages and disadvantages.

Introduction

Iron deficiency is the most common nutritional disorder

around the world and it is considered a public health problem

(McLean

et al

., 2007). Because of iron’s insolubility and

potential toxicity under physiological conditions, special

molecules have evolved for its acquisition, transport and

storage in soluble, nontoxic forms (Kolachala

et al

., 2007). The

mechanism and control of iron uptake by the gut has puzzled

investigators in both

in vivo

and

in vitro

studies (Latunde-

Dada

et al

., 1998; Morgan and Oates, 2002; Latunde-Dada,

2009). Studies about the effect of iron are focused mainly in

two ways; basic studies to elucidate iron metabolism, and

nutritional studies to evaluate the efficacy of iron supple-

mentation to prevent or treat iron deficiency and anemia

(Lynch and Stoltzfus, 2003; Nadadur

et al

., 2008; Theurl

et al

.,

2008; West and Oates, 2008; Lo¨nnerdal, 2009). There are

many studies available in the scientific literature about

iron absorption and regulation. Iron supplementation studies

determine factors that affect iron absorption and oxidative

damage (Beach

et al

., 2003; Casanueva and Viteri, 2003;

Troost

et al

., 2003; Lonnerdal

et al

., 2006; Nagababu

et al

.,

2008; Jin

et al

., 2009).

-

Present address: Department of Physiology, Faculty of Pharmacy, Campus

Universitario de Cartuja, University of Granada. E-mail: [e-mail]

1651

---

A variety of experimental models have been used in

studies related to iron through the time (Latunde-Dada

et al

.,

1998; Srigiridhar and Nair, 2000; Morgan and Oates, 2002;

Troost

et al

., 2003; Nagababu

et al

., 2008; Quintero

et al

., 2008;

Jin

et al

., 2009; Latunde-Dada, 2009). Nevertheless,

in vitro

systems or animal models have different iron metabolism

behaviour when compared with humans (Latunde-Dada

et al

.,

1998; Vaghefi

et al

., 2005; Patterson

et al

., 2008; Quintero

et al

., 2008). Studies related to iron involve different procedures

including isotopic techniques, simulated enzymatic gastro-

intestinal digestion or hemoglobin (Hb) depletion–repletion

(Srigiridhar and Nair, 2000; Beach

et al

., 2003; Vaghefi

et al

.,

2005; Kolachala

et al

., 2007; Quintero

et al

., 2008). This paper

reviews the main experimental models commonly used in iron

metabolic and nutritional studies, including their advantages

and disadvantages.

Iron metabolism

Iron is complexed in the food, and the nature of the foodstuff

determines its bioavailability. In most cases, dietary iron has to

be dissociated and made soluble in order for the iron to be

absorbed. The usually low pH of the stomach serves this func-

tion, releasing iron and maintaining it in Fe

3

1

state (Bothwell

et al

., 1979; Andrews, 1999). Once released, free iron comes

into contact with absorptive cells of the proximal small intestine.

Iron absorption takes place in the duodenum and the

proximal jejunum (Nadadur

et al

., 2008). Nonheme iron is

rendered soluble in gastric secretion and remains soluble in

the upper small intestine; its absorption is mediated by

divalent metal transporter 1 (DMT1). Heme iron from Hb or

myoglobin is transported by a protein namely PCFT/HCP1

and FLVCR, that acts also as a folate transporter and this

seems to be its main role. This transporter protein appears

to function independently of the putative heme receptor

and receptor-mediated endocytosis and it acts as a direct

heme iron transfer process across plasma membranes (Qiu

et al

., 2006).

Ferroportin (FPN) plays a role in iron transport enterocytes

and in iron release from hepatocytes and macrophages.

The diffusion of Fe

2

1

across the basolateral membrane

is facilitated by FPN and Hephaestin, a membrane-bound

protein that promotes oxidation of Fe

2

1

to Fe

3

1

prior to its

release from transporter molecule. The cellular iron uptake,

storage and efflux depend on the functional demands of the

different cell types. In the majority of eukaryotic cells, iron

uptake occurs primarily by transferrin receptor (TFR)-mediated

endocytic pathway. There are two TFRs, namely TFR-1 and

TFR-2. The TFR-1 features a high affinity binding the complex

transferrin-Fe

2

1

, and it has a key role involved on iron uptake

in the majority of cells, while TFR-2 is expressed primarily in

liver and binds the complex transferrin-Fe

3

1

with lower affinity

(Nadadur

et al

., 2008). In addition to the cellular acquisition of

iron by the classic transferrin-dependent pathway, there is

another pathway, the uptake of nontransferrin-bound iron

(NTBI) that requires iron reduction and subsequent cellular

uptake of Fe

2

1

by DMT1 (Lane and Lawen, 2008). The iron

reduction of NTBI and uptake is mediated by mucosal ferric

reductases such as Duodenal Cytochrome b (Dcytb; Krause

et al

., 2000). In presence of catalytic concentrations of ascor-

bate, Dcytb may catalyze electron transfer from intracellular

ascorbate to extracellular ascorbyl free radical to generate

ascorbate, which could then directly donate a single electron to

Fe

3

1

or Cu

2

1

. These results are supported by a novel model of

NTBI reduction and uptake pathway in K562 erythroleukemia

cells (Lane and Lawen, 2008). Figure 1 summarizes iron

absorption pathways in the intestinal enterocyte.

The stored iron accounts for 20% to 30% of body iron and

the majority is bound to ubiquitin and the highly conserved iron

Figure 1

Summary diagram of iron absorption pathways in the intestinal enterocyte. Nonheme iron: All nonheme iron is ultimately taken up from the lumen

by divalent metal transporter (DMT1) situated on the microvillus membrane, before joining the labile iron pool in the cytoplasm. Ferric iron must first be

reduced to the ferrous form by Dcytb before uptake. Ferrous iron in the labile iron pool is then transferred to the circulation by ferroportin (FPN), which requires

hephaestin for oxidation to the ferric form in order to bind to circulating transferrin. Heme iron: Heme iron is taken up by receptor-mediated endocytosis.

Internalized heme iron is degraded by Heme-oxigenase, releasing nonheme iron. The nonheme iron is then transported to the cytoplasm, joined to the labile

iron pool and is transferred to the bloodstream by FPN in the same manner as nonheme iron.

Garcı´a and Dı´az-Castro

1652

---

binding protein, ferritin (Nadadur

et al

., 2008). Absorption is

regulated according to the body’s needs by hepcidin, a small

cysteine-rich cationic peptide currently considered as the most

important factor controlling iron absorption (Lynch, 2007).

A study using human biopsies and rats concluded that the

intestine iron uptake takes place through a sequential transfer

involving interaction of luminal transferrin, transferrin–TFR and

ferritin (Kolachala

et al

., 2007).

In addition, levels of key proteins in the absorptive

enterocyte are influenced by oxygen tension in the cell,

which, in turn, affects the transcription factor hypoxia-

inducible factor 2

a

(HIF-2

a

) (Mastrogiannaki

et al

., 2009).

This fact leads to subsequent changes in the transcription of

DMT1 and FPN. In addition, the content of iron within the

enterocyte regulates iron absorption through its effects

on iron regulatory proteins (IRP) types 1 and 2 and their

subsequent effect on mRNAs encoding DMT1, FPN, ferritin

and HIF-2

a

. (Galy

et al

., 2008). The IRPs bind to specific

sequences (iron-responsive elements ) that influence mRNA

translation (linked with FPN, ferritin and HIF-2

a

) or stability

(linked with TfR-1 and DMT1; Sa´nchez

et al.

, 2007). Conse-

quently, presence of hypoxia or cellular iron deficiency,

DMT1 and FPN are upregulated, promoting iron absorption

from the diet.

Hepcidin is secreted into the circulation by hepatocytes

and play a key role in the regulation of iron metabolism.

Hepatic hepcidin levels are regulated by iron stores, hypoxia,

erythropoietic rate and inflammatory status (Nicolas

et al

.,

2002). Hepcidin acts by blocking the iron efflux into the

blood circulation from the gut and the macrophages by

binding to the iron transporter FPN, resulting in its ubiqui-

tylation and degradation. Low levels of circulating hepcidin

are associated with many forms of genetic iron overload

(Nemeth and Ganz, 2006). Various signaling pathways have

been shown to regulate hepatic hepcidin levels with bone

morphogenetic proteins (BMPs) which signal via intracellular

proteins that transduce extracellular signals to the nucleus

where they activate downstream gene transcription. These

proteins are homologs of both the Drosophila protein, mothers

against decapentaplegic (MAD) and the Caenorhabditis ele-

gans protein SMA (from gene SMA for small body size). The

name of this group of proteins (SMADs) is a portmanteau of

the two and they are emerging as key regulators of iron

metabolism (Meynard

et al

., 2009). The BMP/SMAD4 pathway

has major effects on liver hepcidin levels. Bone morphogenetic

protein-binding endothelial cell precursor-derived regulator

(BMPER), a known regulator of BMP signaling, was found to

be overexpressed at the mRNA and protein levels in liver of

genetically hypotransferrinemic mice (Trfhpx/hpx). Soluble

BMPER peptide inhibited BMP2- and BMP6-dependent hepci-

din promoter activity in both HepG2 and HuH7 cells. Addition

of BMPER peptide to primary human hepatocytes abolished

the BMP2-dependent increase in hepcidin mRNA, whereas

injection of BMPER peptide into mice resulted in reduced liver

hepcidin and increased serum iron levels. Thus BMPER may

play an important role in suppressing hepcidin production in

hypotransferrinemic mice (Patel

et al

., 2012).

Common methods used in Fe metabolism

In vitro experimental models

Because iron absorption takes place at the intestinal level,

several

in vitro

studies have used different fragments of gut,

such as enterocyte suspensions

,

brush border membranes and

vesicles, perfused duodenal segment or everted gut sacs

(Simpson

et al

., 1986; Goddard

et al

., 1997; Moshtaghie,

2006). To minimize the effect of the lack of a mucous layer

in enterocyte suspensions, ascorbate was used as a quasi-

physiological substitute for gut lumen iron chelators (Goddard

et al

., 1997).

Caco-2, derived from human colonic adenocarcinoma

cells is a suitable model to study iron absorption. Although

Caco-2 cells are originally colonic, they differentiate in culture,

developing brush border membranes and exhibiting transport

properties similar to intestinal epithelia. With regards to iron

uptake, many investigators agree that Caco-2 cell monolayers

are valid models which can be used to define the mechanisms

of iron absorption as well as to investigate factors which

affect iron availability (Glahn and Van Campen, 1997; Zhu

et al

., 2006; Arredondo

et al

., 2008). The cells express

profusely abundant intestinal microvilli, enzymes and differ-

entiation markers typical of human small intestinal entero-

cytes. Thus, Caco-2 cells are potentially useful as an

in vitro

model to elucidate vectorial epithelial passage by para- and

transcellular routes. The cell cultures have demonstrated

several uptake characteristics observed in animal and human

studies. Iron uptake by the apical surface is transported to the

basolateral pole in a process that is saturable and facilitated

not only by iron ionization, but also by the iron status of the

cell. In addition, Caco-2 cells resynthesize three important

proteins involved in iron metabolism, apotransferrin, trans-

ferrin and ferritin (Latunde-Dada

et al

., 1998).

BeWo is a human placental cell line derivated from a

choriocarcinoma. These cells have been used as an

in vitro

model to study placental uptake a variety of nutrients including

glucose, amino acids and iron. However, unlike Caco-2 cells,

which are widely used in a similar culture system as a model of

intestinal epithelial cell transport, BeWo cells do not feature

the contact inhibition of growth. This fact makes more difficult

to obtain them and sustain an intact cell monolayer that would

be optimal for transport studies. Furthermore, the permeability

of BeWo cells layers is dependent on the molecular size of the

substrate applied (Heaton

et al

., 2008).

Animal models used to study iron homeostasis

Most of our knowledge on iron homoeostasis relies on

studies performed on mice. Several genetic models are avail-

able, including both natural and gene targeting generated

mutations of the main genes involved in iron absorption,

recycling, storage and utilization. The mouse also represents a

unique model to identify novel regulators of iron homoeostasis

because its behavior is similar to humans in disorders such

as hemochromatosis and anemia (Fiorito

et al

., 2012). For

instance, the significant role of DMT1 in iron intestinal

absorption was evident in studies in microcytin anemic

Fe metabolism: animal and

in vitro

models review

1653

---

mice and Belgrade rat. A spontaneous mutation (G185R)

found in both strains caused significant defects in intestinal

iron absorption and assimilation by eritroid precursors cells

(Fleming

et al

., 1998). Moreover, the targeted mutation of

murine DMT1 gene (Slc11a2-/- mice) further confirmed its role

in intestinal iron absorption (Gunshin

et al

., 2005). Embryonic

lethality observed in TFR-1 knockout mice further reinforces

the important role of TFR-1 in cellular iron uptake (Hentze

et al

., 2004). Severe anemia and rapid accumulation of iron in

FPN deficient mice suggested that FPN is essential for iron

recycling (Donovan

et al

., 2005). The study of iron-overload in

the upstream stimulatory factor 2 (USF-2) knockout mice led to

the serendipitous discovery of hepcidin (HAMP) gene (Nicolas

et al

., 2001). Targeted deletion of hepcidin gene in mice or

mutations in human gene result in elevated body iron stores,

presumably because of hyperabsorption associated with

decreased iron in macrophages (Knutson

et al

., 2003).

Transgenic knockout mouse models of IRP1, IRP2 indicate

that the double knockout is embryologically lethal (Smith

et al

., 2004). Observation of no overt phenotype for IRP1-/-

knockout mouse is rather surprising and suggests that IRP2

can compensate for the loss of IRP1. Mouse models of IRP2

knockout exhibited increased iron content and expression of

DMT1, ferritin and FPN. These observations suggest that

other unidentified factors may participate along with IRPs in

cellular iron homeostasis (Hentze

et al

., 2004). In mouse, a

model of hereditary hemochromatosis was developed, which

is an iron-overload disorder resulting from mutations in

hemojuvelin, a protein involved in the maintenance of iron

homeostasis (Huang

et al

., 2005).

Animal models used for nutritional studies

Many nutritional studies related to iron are performed in

humans (Beach

et al

., 2003; Troost

et al

., 2003; Lonnerdal

et al

.,

2006). Nevertheless, human research in basic metabolism is

expensive and difficult to perform accurately. Animal studies

are used in primary studies and sometimes followed with

selective studies in people. Traditionally, rats have been the

model of choice when performing nutritional studies. However,

the rat model has a number of limitations which makes extra-

polation to humans really questionable, including a significantly

different energy and food intake, a different lifespan and body

proportion, differences in intestinal morphology and enteric

microbiota, as well as other distinct physiological differences.

Another major problem with using rat models for mineral

studies is their propensity for practicing coprophagy. Although

this is an effective way for animals to recycle nutrients and

maximize nutrient absorption, it may have a dramatic impact

on the results of a nutritional study (Quintero

et al

., 2008).

Some putative iron-binding proteins isolated from rats have

also been demonstrated to have biological activity in humans.

The absorption and metabolism of heme iron are known

to occur in the rat mucosa similar to that in humans, even if

the absorption of heme iron is lower in the rodent. Another

difference between iron metabolism in rats and humans is the

relatively high mucosal cell turnover in rats leading to higher

iron losses. Iron absorption in rats is more dependent on serum

iron levels than on internal iron turnover or iron stores as in

humans. The expected increase of nonheme iron absorption

when meat protein is added to the diet is also very difficult to

demonstrate in rats (Hartmann and Bissel, 1982; Gordon and

Godber, 1989; Conrad

et al

., 1992; Roberts

et al

., 1993).

Although no animal model will ever perfectly mimic

the human condition, the pig has emerged as a superior

nonprimate experimental model because despite some

anatomic differences, the physiology of digestion and

associated metabolic processes are very similar between

humans and pigs (Miller and Ullrey, 1987; Swindle

et al

.,

1994). Pigs are also the only widely utilized animal model

that is truly omnivorous, and they have strikingly similar

nutritional requirements to that of humans. Although the

porcine model bears some remarkable similarities to

humans, it is important to recognize that there are some

differences between the two species, which may lead to a

differing response to certain experimental regimes. Although

the physiology of digestion and associated metabolic pro-

cesses are alike between pigs and humans, it should be

recognized that the absolute length and weight of the

intestine does differ. Differences in body fat content between

pigs and humans could translate into differences in nutrient

absorption in cases of severe obesity. Incidentally, pigs

practice coprophagy, which can be another confounding

experimental factor, but this practice is quite rare in pigs, as

compared with rats that frequently practice coprophagy

(Quintero

et al

., 2008)

.

The broiler chicken may be a useful model for initial

in vivo

screening of Fe bioavailability in foods because of its growth

rate, anatomy, size and low cost. This model exhibited the

appropriate responses to Fe deficiency and has potential to

serve as a model for Fe bioavailability. Such a model should

be most useful as an intermediate test of

in vivo

Fe bio-

availability observations in preparation for subsequent human

studies (Tako

et al

., 2010).

Animal models used for gestational iron studies

Animal models are capable of providing important informa-

tion on the causal link between restricted dietary iron intake,

induction of gestational iron deficiency anemia and adverse

pregnancy outcomes. Gestational iron deficiency anemia has

been studied in laboratory rodents. However, rodents do not

provide an adequate model for the effects of third-trimester

iron deficiency anemia on the fetus. Rodents are precocial,

and the pups are born shortly after completion of organo-

genesis, whereas an extended period of postembryonic

intra-uterine development occurs in human and nonhuman

primates. Rodents, the most common laboratory animal

model for human developmental experiments, complete

embryogenesis at 15 to 16 days of gestation and are typically

born at 18 to 21 days of gestation.

In addition, rhesus monkeys have single-offspring preg-

nancies and are known to display hematologic changes

similar to those of humans in late pregnancy. Although

the biology of pregnancy is similar in monkeys and humans,

the environmental standardization possible in nonhuman

Garcı´a and Dı´az-Castro

1654

---

primate studies, and the related lack of confounding factors

markedly increases the sensitivity of small-sample experi-

ments (Golub

et al

., 2006). Monkeys and rodents show us

important evidence about the relation of iron deficiency

anemia during gestation and lactation and a vulnerable

period in early development that may result in long-lasting

damage (Beard, 2007).

Advantages and disadvantages of in vitro and ex-vivo

techniques

Researchers have developed

in vitro

techniques to

study iron availability. One of the most ancient methods

to estimate dietary iron availability included a simulated

gastrointestinal digestion, followed by measurement of

soluble and/or dialyzable low molecular weight iron to

investigate the chemically available iron in a wide variety of

foods (Miller

et al

., 1981). This work used radioisotopes

of iron to measure available iron, but another group used

the same

in vitro

method to study changes in ferritin

iron and protein during cooking and gastric digestion by

measuring ferritin concentrated by a gel filtration column

(Hoppler

et al

., 2008). These methods could use iron

availability quantification with spectrophotometric methods

using an iron chromogen such as 1,10 Phenantroline or

Ferrozine because of the specific reaction with Fe

2

1

. They

serve as methods for ranking or categorizing foods

with respect to the effects of variables such as species,

processing, cooking, etc. Simulated

in vitro

digestion is

not a method on its own to measure iron availability. How-

ever, it may be used as a prestep, for example, to cell

studies. These results cannot be extrapolated to absorption

in the human intestine. They are useful in predicting the

trends, but not the magnitude, of the absorptive response

in humans.

Everted gut sac is an

ex-vivo

systems used since the

middle of the past century in basic studies to elucidate

the mechanism of intestinal iron uptake with contradictory

results. In an attempt to resolve these divergent views,

the use of this technique was examined in studies of iron

absorption and used radio-iron isotopes of

59

Fe (Pearson

and Reich, 1965). This system proved to be susceptible to

large errors at low iron concentrations. The methods of

multiple transfers permitted precise estimation of uptake

because the initial and final counts in the incubation

medium could be determined easily, without having to

transfer from the incubation vessel to the counting tube

with the associated concomitant losses.

In vitro

gut

sac systems have a relative insensitivity to physiological

changes known to alter iron uptake

in vivo

, suggesting that

mucosal participation in iron transport may have an extra-

mucosal control. Nevertheless, researchers have continued

to use everted gut sac systems in studies of iron interaction

with other metals such as manganese and aluminium

(Moshtaghie and Taher, 1993; Moshtaghie, 2006).

Another of the

ex-vivo

systems is the

Ussing

chamber that

had been used to elucidate the influence of heme iron and

peptide release during globin hydrolysis and cysteine during

iron absorption. This experimental system uses fully orga-

nized digestive membranes, including the mucus layer that

affects the diffusion of iron from lumen to enterocytes. This is

an advantage of an

Ussing

chamber in relation to a perfused

duodenal segment, everted gut sac or enterocyte suspension

where the wash buffer and manipulation damage the mucus

layer (Vaghefi

et al

., 2005).

Isotopes provide an invaluable means for studying the

metabolism of iron. Stable isotopes of iron are

54

Fe,

57

Fe and

58

Fe. Because stable isotopes have virtually no health risk

in their use, they can be used in measured amounts to

trace how the micronutrients are metabolized by the body.

This technique is considered the ‘gold standard’ for iron and

other nutrient bioavailability studies in humans, including

children. Isotopic methods were used to measure the effect-

iveness of fortification and supplementation programmes

in several countries (Aggett, 1999; Walczyk

et al

., 2005;

Moretti

et al

., 2006). There are two radioactive isotopes of

iron suitable for use as biological tracers,

55

Fe and

59

Fe. In

addition to the use of these isotopes individually, it is often

desirable to introduce both

55

Fe and

59

Fe as a dual tracer

in an experiment and determine the activity of each inde-

pendently (Swindle

et al

., 1994; Pizarro

et al

., 2002). The

hazards associated with the use of radioactive materials,

the radioisotope could be replaced with a stable isotope

(Morais

et al

., 1996; Zinn

et al

., 1999).

Iron absorption has been studied in mice by using the

radioisotopes

55

Fe and

59

Fe in tied-off or dissected and everted

duodenal segments. Owing to several drawbacks, the exten-

ded use of these approaches is discouraged because after oral

administration of

57

Fe-containing solutions, it is possible to

measure both duodenal iron retention and duodenal iron

transfer to specific organs using inductively coupled plasma

mass spectrometry (ICP-MS). As

57

Fe is administered orally, no

surgery is needed before the end of the experiment, thus

allowing the measurement of iron absorption under physio-

logic conditions. Moreover, the use of ICP-MS for

57

Fe detection

ensures high sensitivity and provides quantitative data (Fiorito

et al

., 2012). A similar methodology was used to study the iron

absorption and bioavailability from supplemented formula

milk administrated to lactating rats (Gonza´lez-Iglesias

et al

.,

2012). The Hb repletion assay is widely used in weanling

pig model to asses serum iron and Hb regeneration. The

animals are fed the experimental diets for a period of 1, 2, 5 or

20 weeks. Blood volume is estimated from BW and then

hemoglobin regeneration efficiency is calculated (South

et al

.

2000; Quintero

et al

., 2008).

The broiler chicken was used as a model to study iron

bioavailability with a unique duodenal loop technique for

direct measurement of intestinal iron absorption. One-week-

old chicks were allocated into iron-deficient

v

. iron-adequate

treatment groups for 6 weeks. At week 7, birds were anes-

thetized and their duodenal loops were exposed. The loop

was isolated and a nonocclusive catheter was inserted into

the duodenal vein for blood sampling. A stable isotope

solution containing

58

Fe was injected into the loop. Blood

samples were collected every 5 min for 120 min postinjection

Fe metabolism: animal and

in vitro

models review

1655

---

Table 1

Main advantages and disadvantages of the models

In vitro

Animal models

Caco-2 cells

BeWo cells

Ex vivo

Mouse

Rat

Pig

Broiler chicken

Rhesus monkeys

Advantages

Differentiates in culture,

developing brush border

membranes, exhibiting

transport properties

similar to intestinal

epithelia (Glahn and Van

Campen, 1997; Zhu

et al., 2006; Arredondo

et al., 2008)

Ussing chamber uses fully

organized digestive membranes,

avoiding the wash buffer and

manipulation damage to the

mucus layer (Vaghefi

et al., 2005)

Behavior similar to humans in

disorders such as

hemochromatosis and

anemia (Fleming

et al., 1998;

Knutson

et al., 2003; Hentze

et al., 2004; Smith et al., 2004;

Donovan

et al., 2005; Gunshin

et al., 2005; Huang et al., 2005;

Fiorito

et al., 2012)

The absorption and

metabolism of heme

iron are known to

occur in the rat mucosa

similar to that in

humans, even if the

absorption of heme

iron is lower in the

rodent

The physiology of digestion

and associated metabolic

processes are very similar

between humans and pigs

(Miller and Ullrey, 1987;

Swindle

et al., 1994)

Growth rate, anatomy,

size and low cost.

Appropriate responses

to Fe deficiency and has

potential to serve as a

model for Fe

bioavailability (Tako

et al., 2010)

Single-offspring

pregnancies and are

known to display

hematologic changes

similar to those of

humans in late

pregnancy (Golub

et al.,

2006)

Express abundant

intestinal microvilli,

enzymes and

differentiation markers

typical of human

enterocytes

Stable isotopes of iron are

54

Fe,

57

Fe and

58

Fe. Because stable

isotopes have virtually no health

risk, they can be used in

measured amounts to trace how

the micronutrients are

metabolized by the body

(Aggett, 1999; Walczyk

et al.,

2005; Moretti

et al., 2006)

Truly omnivorous, and they

have strikingly similar

nutritional requirements

to that of humans

Resynthesize apotransferrin,

transferrin1 and ferritin

(Latunde-Dada

et al.,

1998)

Disadvantages

Do not feature the

contact inhibition

Radio-iron isotopes of

59

Fe are

susceptible to large errors at low

iron concentrations (Pearson and

Reich, 1965)

Significantly different

energy and food intake,

a different lifespan and

body proportion,

differences in intestinal

morphology and enteric

microbiota compared

with humans

Differences in body fat

content between pigs and

humans could translate

into differences in

nutrient absorption in

cases of severe obesity.

Incidentally, pigs practice

coprophagy, but this

practice is quite rare in

pigs, as compared with

rats that frequently

practice coprophagy

(Quintero

et al., 2008)

More difficult to obtain

them and sustain a

monolayer.

Practicing coprophagy

(Quintero

et al., 2008)

Permeability is dependent

on the molecular size

of the substrate

applied (Heaton

et al.,

2008)

Iron absorption is more

dependent on serum

iron levels than on

internal iron turnover as

in humans (Hartmann

and Bissel, 1982;

Gordon and Godber,

1989; Conrad

et al.,

1992; Roberts

et al.,

1993)

Garcı

´a

and

Dı

´az-Castro

1656

---

for measurement of

58

Fe concentrations. Tako

et al

. (2010)

evaluated expression of proteins involved in Fe uptake and

transfer as DMT1, FPN1 and Dcytb as an indicator of iron

bioavailability. Table 1 summarizes the main advantages and

disadvantages of the models studied.

Conclusions

Many experimental models have been used since the past

century in studies related to iron, most of which are still cur-

rently in use.

In vitro

models are usually simple, easy to handle

and the results are obtained quickly with lower cost. These are

some advantages in relation to studies in animal or humans.

On the other hand, we have to consider the ethical aspect and

only use animal and human studies when it is necessary.

Isotopic techniques are highly recommended in studies

related to iron, but these are difficult in many routines

worldwide because the experimental design requires a lot of

special logistic conditions which are currently not feasible

in many developing countries. Knowing about the main

advantages and disadvantages of the

in vitro

and animal

models used in studies related to iron is crucial to the

researcher in the field of nutritional studies.

References

Aggett PJ 1999. Iron, copper, and zinc absorption and turnover; the use of stable

isotopes. European Journal of Pediatrics 156, S29–S34.

Andrews NC 1999. Disorders of iron metabolism. New English Journal of

Medicine 341, 1986–1995.

Arredondo M, Kloosterman J, Nu´n˜ez S, Segovia F, Candia V, Flores S, Le Blanc S,

Olivares M and Pizarro F 2008. Heme iron uptake by Caco-2 cells is a saturable,

temperature sensitive and modulated by extracellular pH and potassium.

Biological Trace Element Research 125, 109–119.

Beach SB, Hansen M, Bukhave K, Jensen M, Sorensen SS, Kristensen L,

Purslow PP, Skibsted LH and Sandstrom B 2003. Non heme iron absorption from

a phytate rich meal is increased by the addition of small amounts of pork meat.

American Journal of Clinical Nutrition 77, 173–179.

Beard J 2007. Recent evidence from human and animal studies regarding iron

status and infant development. Journal of Nutrition 137, 524S–530S.

Bothwell TH, Charlton RW, Cook JD and Finch CA 1979. Iron metabolism in man.

Blackwell Scientific, Oxford, UK.

Casanueva E and Viteri FE 2003. Iron and oxidative stress in pregnancy. Journal

of Nutrition 133, 1700S–1708S.

Conrad ME, Umbreit JN, Moore EG and Rodning CR 1992. Newly

identified iron-binding protein in human duodenal mucosa. Blood 79,

244–247.

Donovan A, Lima CA, Pinkus JL, Pinkus GS, Zon LI, Robine S and Andrews NC

2005. The iron exporter ferroportin/slc40a1 is essential for iron homeostasis.

Cell Metabolism 1, 191–200.

Fleming MD, Romano MA, Su MA, Garrick LM, Garrick MD and Andrews NC

1998. Nramp2 is mutated in the anemic Belgrade (b) rat: evidence of a role for

Nramp2 in endosomal iron transport. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America 95, 1148–1153.

Fiorito V, Geninatti SC, Silengo L, Altruda F, Aime S and Tolosano E 2012.

Assessment of iron absorption in mice by ICP-MS measurements of

57

Fe levels.

European Journal of Nutrition 51, 783–789.

Galy B, Ferring-Appel D, Kaden S, Grone HJ and Hentze MW 2008. Iron

regulatory proteins are essential for intestinal function and control key iron

absorption molecules in the duodenum. Cell Metabolism 7, 79–85.

Glahn RP and Van Campen DR 1997. Iron uptake is enhanced in caco-2 cell

monolayers by cysteine and reduced cysteinyl glycine. Journal of Nutrition 127,

642–647.

Goddard WP, Coupland K, Smith JA and Lon RG 1997. Iron uptake by isolated

human enterocyte suspensions in vitro is dependent on body iron stores and

inhibited by other metal cations. Journal of Nutrition 127, 177–183.

Golub MS, Hogrefe CE, Germann SL, Capitanio JP and Lozoff B 2006. Behavioral

consequences of developmental iron deficiency in infant rhesus monkeys.

Neurotoxicology and Teratology 28, 3–17.

Gonza´lez-Iglesias H, Ferna´ndez-Sa´nchez ML, Lo´pez-Sastre J and Sanz-Medel A

2012. Nutritional iron supplementation studies based on enriched (57) Fe,

added to milk in rats, and isotope pattern deconvolution-ICP-MS analysis.

Electrophoresis 33, 2407–2415.

Gordon DT and Godber JS 1989. The enhancement of nonheme iron

bioavailability by beef protein in the rat. Journal of Nutrition 119, 446–452.

Gunshin H, Fujiwara Y, Custodio AO, Direnzo C, Robine S and Andrews NC

2005. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis

but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation 115,

1258–1266.

Hartmann F and Bissel M 1982. Journal of Clinical Investigation 70, 23–29.

Heaton SJ, Eady J, Parker ML, Gotts KL, Dainty JR, Fairweather-Tait SJ, McArdle

HJ, Srai KS and Elliott RM 2008. The use of BeWo cells as an in vitro model for

placental iron transport. American Journal of Physiology – Cell Physiology 295,

C1445–C1453.

Hentze MW, Muckenthaler MU and Andrews NC 2004. Balancing acts:

molecular control of mammalian iron metabolism. Cell 117, 285–297.

Hoppler M, Schonbachler A, Meile L, Hurrell RF and Walczyk T 2008. Ferritin-iron

is released during boiling and in vitro gastric digestion. Journal of Nutrition 138,

878–884.

Huang FW, Pinkus JL, Pinkus GS, Fleming MD and Andrews NC 2005. A mouse

model of juvenile hemochromatosis. Journal of Clinical Investigation 115,

2187–2191.

Jin F, Frohman C, Thannhauser TW, Welch RM, Glahn RP and Jin F 2009. Effects

of ascorbic acid, phytic acid and tannic acid on iron bioavailability from

reconstituted ferritin measured by an in vitro digestion-Caco-2 cell model.

British Journal of Nutrition 101, 972–981.

Knutson MD, Vafa MR, Haile DJ and Wessling-Resnick M 2003. Iron overloading

and erythrophagocytosis increase ferroportin 1 (FPN1) expression in J774

macrophages. Blood 102, 4191–4197.

Kolachala VL, Sesikeran B and Nair KM 2007. Evidence for a sequential transfer

of iron amongst ferritin, transferrin and transferrin receptor during duodenal

absorption of iron in rat and human. World Journal of Gastroenterology 13,

1042–1052.

Krause A, Neitz S, Magert HJ, Schulz A, Forssmann WG, Schulz-Knappe P and

Adermann K 2000. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide,

exhibits antimicrobial activity. Febs Letter 480, 147–150.

Lane DJR and Lawen A 2008. Non-transferrin iron reduction and uptake are

regulated by transmembrane ascorbate cycling in k562 cells. Journal of

Biological Chemistry 283, 12701–12708.

Latunde-Dada GO 2009. Iron metabolism: microbes, mouse, and man. BioEssays

31, 1309–1317.

Latunde-Dada GO, Pires-Bianchi ML and Dutra-Oliveira JE 1998. On the

methods for studying the mechanism and bioavailability of iron. Nutrition

Reviews 3, 76–80.

Lo¨nnerdal B 2009. Soybean ferritin: implications for iron status of vegetarians.

Amercian Journal of Clinical Nutrition 89, 1680S–1685S.

Lonnerdal B, Bryant A, Liu X and Theil E 2006. Iron absorption from soybean

ferritin in non anemic woman. American Journal of Clinical Nutrition 83,

103–107.

Lynch S 2007. Iron metabolism. In Nutritional anemia. (ed. K Kraemer and

MB Zimmermann), pp. 66–67. Sight and Life Press, Basel, Switzerland.

Lynch SR and Stoltzfus RJ 2003. Iron and ascorbic acid: proposed fortification levels

and recommended iron compounds. Journal of Nutrition 133, 2978S–2984S.

Mastrogiannaki M, Matak P, Keith B, Simon MC, Vaulont S and Peyssonnaux C

2009. HIF-2alpha, but not HIF-1alpha, promotes iron absorption in mice. Journal

of Clinical Investigation 119, 1159–1166.

McLean E, Egli I, de Benoist B, Wojdyla D and Cogswell M 2007.

Worldwide prevalence of anemia in preschool aged children, pregnant women

and non-pregnant women of reproductive age. In Nutritional anemia (ed.

K Kraemer and MB Zimmermann), pp. 108–109. Sight and Life Press, Basel,

Switzerland.

Fe metabolism: animal and

in vitro

models review

1657

---

Meynard D, Kautz L, Darnaud V, Canonne-Hergaux F, Coppin H and Roth MP

2009. Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron

overload. Nature Genetics 41, 478–481.

Miller DD, Schricker BR, Rasmussen RR and Van Campen D 1981. An

in vitro

method for estimation of iron availability from meals. American Journal of

Clinical Nutrition 34, 2248–2256.

Miller ER and Ullrey DE 1987. The pig as a model for human nutrition. Annual

Review of Nutrition 7, 361–382.

Morais MB, Feste A, Miller RG and Lifschitz CH 1996. Effect of resistant and

digestible starch on intestinal absorption of calcium, iron and zinc in infant pigs.

Pediatrics Research 39, 872–876.

Moretti D, Zimmermann MB, Wegmu¨ller R, Walczyk T, Zeder C and Hurrell RF

2006. Iron status and food matrix strongly affect the relative bioavailability of

ferric pyrophosphate in humans. American Journal of Clinival Nutrition 83,

632–638.

Morgan EH and Oates PS 2002. Mechanisms and regulation of intestinal iron

absorption. Blood Cell Molecular and Disease 29, 384–399.

Moshtaghie AA 2006. Investigation of manganese and iron absorption by rat

everted gut sac. Pakistan Journal of Biological Sciences 9, 1346–1349.

Moshtaghie AA and Taher M 1993. Aluminium interference with iron absorption

by everted gut sac. Journal of Islamic World Academic Science 6, 277–281.

Nadadur SS, Srirama K and Mudipalli A 2008. Iron transport and homeostasis

mechanisms: their role in health and disease. Indian Journal of Medical

Resesearch 8, 533–544.

Nagababu E, Gulyani S, Earley CJ, Cutler RG, Mattson MP and Rifkind JM 2008.

Iron deficiency anemia enhanced red blood cell oxidative stress. Free Radical

Research 42, 824–829.

Nemeth E and Ganz T 2006. Hepcidin and iron-loading anemias. Haematologica

91, 727–732.

Nicolas G, Bennoun M, Devaux I, Beaumont C, Grandchamp B, Kahn A and

Vaulont S 2001. Lack of

hepcidin

gene expression and severe tissue iron

overload in upstream stimulatory factor 2 (USF2) knockout mice. Proceedings of

the National Academy of the Sciences USA 98, 8780–8785.

Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, Danan JL, Bigard X, Devaux I, Beaumont C,

Kahn A and Vaulont S 2002. The gene encoding the iron regulatory peptide

hepcidin is regulated by anemia, hypoxia, and inflammation. Journal of Clinical

Investigation 110, 1037–1044.

Patel N, Masaratana P, Dı´az-Castro J, Latunde-Dada GO, Qureshi A, Lockyer P,

Jacob M, Arno M, Matak P, Mitry RR, Hughes RD, Dhawan A, Patterson C,

Simpson RJ and McKie AT 2012. BMPER protein is a negative regulator of

hepcidin and is up-regulated in hypotransferrinemic mice. Journal of Biological

Chemistry 287, 4099–4106.

Patterson JK, Lei XG and Millar DD 2008. The pig as an experimental model for

elucidating the mechanisms governing dietary influence on mineral absorption.

Experimental Biology and Medicine 233, 651–664.

Pearson WN and Reich M 1965. In vitro studies of

59

Fe absorption by everted

intestinal sacs of the rat. Journal of Nutrition 87, 117–124.

Pizarro F, Olivares M, Hertrampf E, Mazariegos DI, Arredondo M, Letelier A and

Gidi V 2002. Iron bis-glycine chelate competes for the nonheme-iron absorption

pathway. American Journal of Clinical Nutrition 76, 577–581.

Qiu A, Jansen M, Sakaris A, Min SH, Chattopadhyay S, Tsai E, Sandoval C,

Zhao R, Akabas MH and Goldman ID 2006. Identification of an intestinal folate

transporter and the molecular basis for hereditary folate malabsorption. Cell

127, 917–928.

Quintero GA, Gonza´lez RG and Sa´nchez MJ 2008. Bioavailability of heme iron of

biscuit filling using piglets as an animal model for human. International Journal

of Biological Sciences 4, 58–62.

Roberts SK, Henderson RW and Young GP 1993. Modulation of uptake of heme

by rat small intestinal mucosa in iron deficiency. American Journal of Physiology

265, G712–G718.

Sanchez M, Galy B, Muckenthaler MU and Hentze MW 2007. Iron-regulatory

proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.

Nature Structural & Molecular Biology 14, 420–426.

Simpson RJ, Raja KB and Peters TJ 1986. Fe

2

1

uptake by mouse intestinal

mucosa in vivo and by isolated intestinal brush-border membrane vesicles.

Biochimica et Biophysica Acta 860, 229–235.

Smith SR, Cooperman S, Lavaute T, Tresser N, Ghosh M, Meyron-Holtz E,

Land W, Ollivierre H, Jortner B, Switzer R 3rd, Messing A and Rouault TA 2004.

Severity of neurodegeneration correlates with compromise of iron metabolism

in mice with iron regulatory protein deficiencies. Annals of The New York

Academy of Sciences 1012, 65–83.

Srigiridhar K and Nair M 2000. Supplementation with

a

-tocopherol or a

combination of

a

-tocopherol and ascorbic acid protects the gastrointestinal

tract of iron-deficient rats against iron-induced oxidative damage during iron

repletion. British Journal of Nutrition 84, 165–173.

South PK, Lei S and Miller D 2000. Meat enhances nonheme iron absorption in

pigs. Nutrition Research 20, 1749–1759.

Swindle M, Smith AC, Laberlaid K and Duncan ML 1994. Swine in biomedical

research: management and models. In Farm animals in biological research. Part

one (ed. M Swindle, AC Smith, K Laberlaid and ML Duncan), pp. 1–8. ILAR news,

Washington.

Tako E, Rutzke MA and Glahn RP 2010. Using the domestic chicken

(Gallus gallus) as an in vivo model for iron bioavailability. Poultry Science 89,

514–521.

Theurl I, Aigner E, Theurl M, Nairz M, Seifert M, Schroll A, Sonnweber T,

Eberwein L, Witcher DR, Murphy AT, Wroblewski VJ, Wurz E, Datz C and Weiss G

2008. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron

deficiency. Blood 113, 5277–5286.

Troost FJ, Saris HW, Haenen GR, Bast A and Brummer RJ 2003. New method to

study oxidative damage and antioxidants in the human small bowel: effect on

iron application. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver

Physiology 285, G354–G359.

Vaghefi N, Nedjaoum F, Guillochon D, Bureau F, Arhan P and Bougle D 2005.

Iron absorption from concentrated hemoglobin hydrolysate by rat. Journal of

Nutritional Biochemistry 16, 347–352.

Walczyk T, Tuntipopipat S, Zeder C, Sirichakwal P, Wasantwisut E and Hurrell RF

2005. Iron absorption by human subjects from different iron fortification

compounds added to Thai fish sauce. European Journal of Clinical Nutrition 59,

668–674.

West AR and Oates PS 2008. Mechanisms of heme iron absorption:

current questions and controversies. World Journal of Gastroenterology 14,

4101–4110.

Zhu L, Glahn RP, Yeung CK and Miller DD 2006. Iron uptake by Caco-2 cells from

NaFeEDTA and FeSO4: effects of ascorbic acid, pH, and a Fe(II) chelating agent.

Journal of Agriculture and Food Chemistry 54, 7924–7928.

Zinn KR, Chaudhuri TR, Mountz JM, van den Berg GJ, Gordon DT and

Johanning GL 1999.

59

Fe is retained from an elemental

59

Fe powder supplement

without effects on

65

Zinc,

47

Calcium and

67

Copper in young pigs. Journal of

Nutrition 129, 181–187.

Garcı´a and Dı´az-Castro

1658

View publication stats

View publication stats